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酶切专家

金虫 (小有名气)

[求助] 关于EcoRI的部分酶切

我准备用EcoRI+XbaI在我的质粒上克隆外源基因,但酶切验证时发现在质粒上有两个EcoRI位点,所以不得不进行部分酶切。
我的计划是:先用XbaI进行完全酶切,然后加少量EcoRI,进行部分酶切(希望出现只在一个EcoRI位点切开的条带),然后回收在我希望的位点切开的那条带,进行克隆。
我已经尝试了一次,发现即使只酶切5分钟,质粒上的两个EcoRI都全切开了。大家有相关经验吗?
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XOooZzz

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
西瓜: 金币+2, Good! 2012-03-18 17:49:17
少加酶,可以尝试4度酶切。
另,如果两个EcoRI间没有细菌选择抗性和复制子等在细菌中的关键元件,可以考虑分两步连接:先用EcoRI+XbaI完全酶切质粒后连接并转化,这样质粒少了两个EcoRI间的序列。然后再用EcoRI酶切上一步的质粒,把缺少的EcoRI间的序列重新连进去。
6楼2012-03-18 00:43:28
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blastfeng

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
最好是甲基化处理,这个也不能保证每一个位点甲基化,只能试试,跑胶,看看酶切程度,再回首,估计工作量很大啊
生活就像PCR
2楼2012-03-17 19:11:18
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a731705125

银虫 (小有名气)

可不可以把质粒突变一下,用pcr的方法把其中一个酶切位点突变掉
3楼2012-03-17 20:40:19
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sarah_lz

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 第一次听说,学习了~ 2012-03-18 17:48:07
EcoRI 活性非常高,基本上酶切鉴定质粒的话,37度五分钟和一个小时的区别不大,所以建议换成别的酶切位点,免得浪费更多时间
4楼2012-03-17 21:42:35
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