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honglix

银虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】求助:电泳后提取的DNA酶切后反而出现一更高分子量条带 已有3人参与

求助:本人从琼脂糖中提取pIT质粒DNA,酶切前为一条3kb左右条带,在进行酶切后,反而出现一5.6kb左右条带,也在400bp左右有一条带。本人考虑为可能提取的DNA复性问题,酶切前的DNA上样孔内有荧光,请教高手解释原因,如何能避免该情况(已排除上样颠倒等情况)。不胜感谢!
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ben1147

木虫 (正式写手)

honglix(金币+10):谢谢。但是为什么同上样量的DNA酶切后显色更明显,是EB插入线性的多么 2010-06-02 20:43:25
酶切前质粒是超螺旋的,当然比酶切后线性的跑得快啊,即使超螺旋分子量比线性的大,也不一定谁跑得快,构象不一样没法比较。单酶切片段的位置才能反应质粒的真实大小


只要酶切后大片段和小片段大小都正确就没事了


上样孔里的荧光可能是大分子量核酸,也可能是染胶液里的杂质
看之前用水冲一冲加样孔
2楼2010-06-02 20:24:46
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cqyniu

金虫 (小有名气)

honglix(金币+5): 2010-06-02 20:51:10
你的那个质粒确定就是3kb吗?还是你跑电泳看的呢?质粒要进行单酶切跑电泳才能确定它的大小的。
3楼2010-06-02 20:39:18
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honglix

银虫 (正式写手)

我提取后跑电泳显示为3kb,未进行酶切,双酶切后显示一5.6kb和400bp,谢谢你们
4楼2010-06-02 20:50:54
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ben1147

木虫 (正式写手)

★ ★
scelab(金币+2):欢迎多来交流!:tiger06: 2010-06-02 22:38:45
honglix(金币+5): 2010-06-08 04:17:51
honglix(金币+2): 2010-06-08 04:18:35
EB插入碱基之间,和DNA是线性还是环状没关系

亮度的差异可能是因为酶切之后条带比较细,DNA集中在一条细线上,显得亮。而超螺旋质粒条带有一定宽度,DNA分散在一个窄的区域里,显得暗
5楼2010-06-02 22:28:48
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cqyniu

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by honglix at 2010-06-02 20:50:54:
我提取后跑电泳显示为3kb,未进行酶切,双酶切后显示一5.6kb和400bp,谢谢你们

那没有什么问题的。你可以做一个单酶切的试试
6楼2010-06-03 08:38:51
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