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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】求助：电泳后提取的DNA酶切后反而出现一更高分子量条带
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honglix

银虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】求助：电泳后提取的DNA酶切后反而出现一更高分子量条带 已有3人参与

求助：本人从琼脂糖中提取pIT质粒DNA，酶切前为一条3kb左右条带，在进行酶切后，反而出现一5.6kb左右条带，也在400bp左右有一条带。本人考虑为可能提取的DNA复性问题，酶切前的DNA上样孔内有荧光，请教高手解释原因，如何能避免该情况（已排除上样颠倒等情况）。不胜感谢!
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1楼 2010-06-02 19:47:50
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ben1147

木虫 (正式写手)
honglix(金币+10):谢谢。但是为什么同上样量的DNA酶切后显色更明显，是EB插入线性的多么 2010-06-02 20:43:25
酶切前质粒是超螺旋的，当然比酶切后线性的跑得快啊，即使超螺旋分子量比线性的大，也不一定谁跑得快，构象不一样没法比较。单酶切片段的位置才能反应质粒的真实大小


只要酶切后大片段和小片段大小都正确就没事了


上样孔里的荧光可能是大分子量核酸，也可能是染胶液里的杂质
看之前用水冲一冲加样孔
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2楼2010-06-02 20:24:46
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cqyniu

金虫 (小有名气)
honglix(金币+5): 2010-06-02 20:51:10
你的那个质粒确定就是3kb吗？还是你跑电泳看的呢？质粒要进行单酶切跑电泳才能确定它的大小的。
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3楼2010-06-02 20:39:18
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honglix

银虫 (正式写手)
我提取后跑电泳显示为3kb,未进行酶切，双酶切后显示一5.6kb和400bp,谢谢你们
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4楼2010-06-02 20:50:54
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ben1147

木虫 (正式写手)
★ ★
scelab(金币+2):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-06-02 22:38:45
honglix(金币+5): 2010-06-08 04:17:51
honglix(金币+2): 2010-06-08 04:18:35
EB插入碱基之间，和DNA是线性还是环状没关系

亮度的差异可能是因为酶切之后条带比较细，DNA集中在一条细线上，显得亮。而超螺旋质粒条带有一定宽度，DNA分散在一个窄的区域里，显得暗
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5楼2010-06-02 22:28:48
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cqyniu

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by honglix at 2010-06-02 20:50:54:
我提取后跑电泳显示为3kb,未进行酶切，双酶切后显示一5.6kb和400bp,谢谢你们

那没有什么问题的。你可以做一个单酶切的试试
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6楼2010-06-03 08:38:51
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