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【求助/交流】噬菌体DNA提取，电泳结果显示不止一条带，等待高手指点 已有6人参与
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我在做噬菌体展示筛选，需要对噬菌体进行DNA提取，可是快一个月了，都没正常过。 请大家指教！不甚感激！ 前几次操作不太对，在碘化钠中重悬没彻底，就加入乙醇，电泳发现一条条带，但很模糊，测序信号弱，失败。 后来提取几次，都是电泳出现不止一条条带。附件是电泳图片。 问题是：用的marker是线状双链DNA 15000bp，我的样品理论上是，单链环状的DNA7225bp左右，可是电泳显示的结果是，四条带，分别是250bp附近一条，1000附近两条，2500b附近一条。 我不明白的是，样品是单链环状的而MARKER是现状直连，相同长度的话，他们电泳的位置显示会在一个位置吗？就算不完全在通一个水平位置，也不至于理论7000多的跑到Marker2500的位置吧? 条带里面根本没有我的目标条带对吗？ 感觉提取方法很简单，网上碰到的朋友也做过，但是他们只用一种仪器测了DNA浓度就测序了，还是成功的，没跑过电泳。老是几条条带，就没送样测序，不知道怎么解决，再考虑换种方法。 我的方法是按照说明书上进行的，很简单，也感觉不出有问题： 噬菌斑的扩增 1. 将 ER2738 过夜培养物按 1:100 稀释接种于 LB 培养基，分 1 ml 到培养管中。每个要鉴 定的克隆一管。一般情况下，由第三轮淘选物中取 10 个克隆便足以检测结合肽中的共 有序列。 2. 用灭菌牙签或吸头，挑一蓝色噬菌斑到上述 1 ml 培养管中。注意：要从总量不到 100 个噬菌斑的平板上挑选，以便保证每个被挑的噬菌斑仅含一个 DNA序列。 3. 37℃摇床培养 4.5-5 hrs（不要过长）。 4. 培养物转入微量离心管中，离心 30 sec。上清转入以新鲜管中. 测序模板的快速纯化1. 将 500 µl含噬菌体上清转入一新鲜离心管 2. 加 200 µl PEG/NaCl，颠倒混匀，室温放置 10 min。 3. 离心 10 min，弃上清液。 4. 短暂离心，小心吸去残余上清。 5. 沉淀物彻底重悬于 100 µl 碘化物缓冲液中，加入 250 µl 乙醇。室温温育 10 min。短时间的室温温育使单链噬菌体 DNA沉淀而大多数噬菌体蛋白保持在溶液中。 6. 离心 10 min，弃上清。用 70%的乙醇洗沉淀，短暂真空干燥。 7. 沉淀重悬于 30 µl 无菌双蒸水中。 最后，0.7%凝胶电泳  |
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wufengjian
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