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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 【求助/交流】噬菌体DNA提取，电泳结果显示不止一条带，等待高手指点
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简约

新虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】噬菌体DNA提取，电泳结果显示不止一条带，等待高手指点已有6人参与

我在做噬菌体展示筛选，需要对噬菌体进行DNA提取，可是快一个月了，都没正常过。

请大家指教！不甚感激！

前几次操作不太对，在碘化钠中重悬没彻底，就加入乙醇，电泳发现一条条带，但很模糊，测序信号弱，失败。
后来提取几次，都是电泳出现不止一条条带。附件是电泳图片。

问题是：用的marker是线状双链DNA 15000bp，我的样品理论上是，单链环状的DNA7225bp左右，可是电泳显示的结果是，四条带，分别是250bp附近一条，1000附近两条，2500b附近一条。
我不明白的是，样品是单链环状的而MARKER是现状直连，相同长度的话，他们电泳的位置显示会在一个位置吗？就算不完全在通一个水平位置，也不至于理论7000多的跑到Marker2500的位置吧? 条带里面根本没有我的目标条带对吗？

感觉提取方法很简单，网上碰到的朋友也做过，但是他们只用一种仪器测了DNA浓度就测序了，还是成功的，没跑过电泳。老是几条条带，就没送样测序，不知道怎么解决，再考虑换种方法。

我的方法是按照说明书上进行的，很简单，也感觉不出有问题：

噬菌斑的扩增
1. 将 ER2738 过夜培养物按 1:100 稀释接种于 LB 培养基，分 1 ml 到培养管中。每个要鉴
定的克隆一管。一般情况下，由第三轮淘选物中取 10 个克隆便足以检测结合肽中的共
有序列。
2. 用灭菌牙签或吸头，挑一蓝色噬菌斑到上述 1 ml 培养管中。注意：要从总量不到 100
个噬菌斑的平板上挑选，以便保证每个被挑的噬菌斑仅含一个 DNA序列。
3. 37℃摇床培养 4.5-5 hrs（不要过长）。
4. 培养物转入微量离心管中，离心 30 sec。上清转入以新鲜管中.

测序模板的快速纯化1. 将 500 µl含噬菌体上清转入一新鲜离心管
2. 加 200 µl PEG/NaCl，颠倒混匀，室温放置 10 min。
3. 离心 10 min，弃上清液。
4. 短暂离心，小心吸去残余上清。
5. 沉淀物彻底重悬于 100 µl 碘化物缓冲液中，加入 250 µl 乙醇。室温温育 10 min。短时间的室温温育使单链噬菌体 DNA沉淀而大多数噬菌体蛋白保持在溶液中。
6. 离心 10 min，弃上清。用 70%的乙醇洗沉淀，短暂真空干燥。
7. 沉淀重悬于 30 µl 无菌双蒸水中。

最后，0.7%凝胶电泳
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1楼2010-05-30 22:53:11
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wufengjian

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+2):欢迎多多交流~~ 2010-05-31 18:54:05
感觉环状DNA提取出来许多带是正常的，想想质粒的提取。而且单链恐怕更是复杂。我看你的图，除了最后一条不像带，其他三条还好。至于测序信号弱，不知引物是否是商业化的。
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2楼2010-05-31 00:12:15
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简约

新虫 (小有名气)
谢谢你的指导。
可能我比较外行，你讲的我不是很明白，我的样品理论上是单链环状的，7225bp左右。Marker是线状单链的D15000，图中Marker的条带从上到下分子量依次是250bp,1000bp,2500bp,5000bp,7500bp,10000bp,15000bp. 所以理论上说，我的样品条带（从右到左1至8号）应该只有一条带，而且在marker倒数第三条带的位置附近。
第一次测序给的引物是买的肽库试剂盒里配套的引物。

辛苦大家给予指导！

[ Last edited by 简约 on 2010-5-31 at 18:59 ]
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3楼2010-05-31 18:52:37
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ben1147

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
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scelab(金币+3):鼓励新虫！欢迎多来交流！:tiger06: 2010-05-31 22:41:37
环状单链的样品和线状双链的marker，结构不一样，没法比的

跟质粒一样，环状跑的要快

而且即使碱基数一样，单链比双链分子量少一半，跑不到一起的
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4楼2010-05-31 21:40:58
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简约

新虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by ben1147 at 2010-05-31 21:40:58:
环状单链的样品和线状双链的marker，结构不一样，没法比的

跟质粒一样，环状跑的要快

而且即使碱基数一样，单链比双链分子量少一半，跑不到一起的

综合你和上面那位同学的讲解，意思是，我的样品电泳结果的位置和条带数并不能很说明提取的DNA的纯度和大小是吗？
上周也勉强送样去测序了，今天还没给结果，一直担心结果不乐观，等测序结果反馈回来再看看。

谢谢你！
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5楼2010-05-31 22:11:15
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伊娃EVA

金虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
可以直接测噬菌斑的啊  我准备到时候直接测噬菌斑 不提模板了
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http://weibo.com/u/3866814223
6楼2011-03-29 08:55:54
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一路向北14

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
楼主，我现在也在提取M13噬菌体单链DNA，跑电泳也是出现两个条带，并且都在2000bp以下。我想问一下你最后是怎么解决问题的？非常急需你的帮助。
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7楼2014-10-30 10:49:47
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jhm2203

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
7楼: Originally posted by 一路向北14 at 2014-10-30 10:49:47
楼主，我现在也在提取M13噬菌体单链DNA，跑电泳也是出现两个条带，并且都在2000bp以下。我想问一下你最后是怎么解决问题的？非常急需你的帮助。

楼上。。我提取M13也是这样的结果，两个条带都在2000bp以下。。不知道生命原因。。请问您解决了?
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8楼2017-12-09 18:57:53
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