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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求高手指点RNA电泳图~~~~
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wanghd2826

铁虫 (小有名气)

[求助] 求高手指点RNA电泳图~~~~

第一次提RNA，用的是RNA iso plus，提取完后用普通1.2%的琼脂糖凝胶电泳跑的，电泳仪等用前均用DEPC水处理过，感觉过程中比较小心，但是结果还是不尽如人意，没有看到明显的18s 和28s，我是继续提纯呢，还是重提RNA呢，请各位提点意见~~谢谢
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1楼 2011-08-20 09:00:42
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wqj1988926

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
西瓜(金币+1): 同意 2011-08-20 22:32:10
重提吧，降解的很厉害呢。
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风雪夜归人
2楼2011-08-20 09:07:11
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wanghd2826

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wqj1988926 at 2011-08-20 09:07:11:
重提吧，降解的很厉害呢。

同感啊 我觉的得重提了，RNA酶简直防不胜防啊。。。郁闷
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3楼2011-08-20 09:19:10
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monkey491816

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
1949stone(金币+2): 鼓励 2011-08-20 20:03:44
应该是你的RNA提取的不好，我之前提取RNA是电泳仪都没有什么处理跑出来的结果肯定是3条带的，胶你用0.8%-1%就可以啦。RNA降解很严重，且有蛋白污染。重新提取一次吧
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4楼2011-08-20 15:49:36
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fangni

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

重新提吧，降解的比较厉害
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5楼2011-08-20 21:05:43
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yixinyuan

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

还是得重提，肯定是又某个环节处理不到位，导致降解！
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6楼2011-08-21 09:19:23
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friya0910

新虫 (正式写手)
★
dhd997(金币+1): 是 2011-08-28 09:45:30
引用回帖:
1楼: Originally posted by wanghd2826 at 2011-08-20 09:00:42:
第一次提RNA，用的是RNA iso plus，提取完后用普通1.2%的琼脂糖凝胶电泳跑的，电泳仪等用前均用DEPC水处理过，感觉过程中比较小心，但是结果还是不尽如人意，没有看到明显的18s 和28s，我是继续提纯呢，还是重提R ...

你提的是什么物种啊？我之前提的时候电泳仪还有电泳液就用以前做DNA的那些，效果也可以，所以我觉得还是操作的时候要小心点！
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7楼2011-08-21 17:36:16
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wanghd2826

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by friya0910 at 2011-08-21 17:36:16:
你提的是什么物种啊？我之前提的时候电泳仪还有电泳液就用以前做DNA的那些，效果也可以，所以我觉得还是操作的时候要小心点！

我提的是昆虫的RNA，应该是过程中降解的太厉害了，但是又找不出到底什么原因，这几天又提了一次，还是不理想，主要是28s降解的太厉害，我把步骤贴出来希望大家看看有什么需要改进的地方。难不成是plus的问题。。。郁闷了。
1、虫体解剖+液氮研磨
2、研磨后转入1.5ml离心管+RNAiso plus 1.ml   充分混匀
3、室温静置5min，4度12000rpm离心5min
4、取上清进入新tube，加1/5体积的氯仿（200ul)，震荡混匀
5、室温静置5min，4度12000rpm离心5min
6、取上清进入tube，加入等体积异丙醇，混匀。
7、室温静置10min，4度12000rpm离心10min
8、弃上清，向沉淀中加入1ml 75%冰冻乙醇清洗沉淀，4度12000rpm 离心10min
9、干燥沉淀 加入20ul DEPC水 取5ul进行电泳
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8楼2011-08-26 08:56:27
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wanghd2826

铁虫 (小有名气)
另外，电泳用的是普通1%的琼脂糖凝胶，100V跑了40min吧（不会跑的过程中降解了吧）
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9楼2011-08-26 09:02:47
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
dhd997(金币+3): good 2011-08-28 09:45:46
wanghd2826(金币+10): 多谢西瓜~ 2011-08-29 09:37:47
引用回帖:
9楼: Originally posted by wanghd2826 at 2011-08-26 09:02:47:
另外，电泳用的是普通1%的琼脂糖凝胶，100V跑了40min吧（不会跑的过程中降解了吧）

40 min太久啦！跑胶过程降解是有可能的，我自己碰到过，当时测OD值看着挺好，未有降解的迹象，但是跑胶却拖尾。猜测是跑胶的问题，然后把缓冲液换成新的再跑，就得到很漂亮的图了。
跑胶的主要目的是看有没有降解和污染，只要看到5S和18S两条亮带没有拖尾就可以了。100V的话10到15分钟已经能区分开这两条带了，没必要跑太久，跑得越久越容易降解。
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10楼2011-08-26 17:25:43
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