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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求高手指点RNA电泳图~~~~
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wanghd2826

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 西瓜 at 2011-08-26 17:25:43:
40 min太久啦！跑胶过程降解是有可能的，我自己碰到过，当时测OD值看着挺好，未有降解的迹象，但是跑胶却拖尾。猜测是跑胶的问题，然后把缓冲液换成新的再跑，就得到很漂亮的图了。
跑胶的主要目的是看有没有降 ...

恩，我觉得跑胶是有问题，但是主要还是提取的过程中降解的厉害，决定再试试，实在不行就得让老板买RNA-free的离心管和抢头了。
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11楼2011-08-27 11:06:32
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5): 2011-08-28 09:45:57
引用回帖:
11楼: Originally posted by wanghd2826 at 2011-08-27 11:06:32:
恩，我觉得跑胶是有问题，但是主要还是提取的过程中降解的厉害，决定再试试，实在不行就得让老板买RNA-free的离心管和抢头了。

提取过程中降解你是怎么看出来的？
RNA酶-free的EP管和枪头建议还是要买，不会很贵的，用DEPC处理既有潜在的危险，也麻烦，时间也是成本呢。
我现在提RNA几乎不用DEPC了，提取过程中，也就最后一步溶解RNA时用到DEPC处理过的水，这个用量很少，弄一次分装到EP管里，可以用很久。
跑胶时用的缓冲液，我也不用DEPC处理过的水来配，都是普通水配的跑DNA的TAE。只不过用了一套专门跑RNA的电泳槽，每次跑RNA时都用新稀释的TAE。
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12楼2011-08-27 21:57:42
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xuzhu598

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
dhd997(金币+3): 很好啊 2011-08-28 09:46:14
引用回帖:
8楼: Originally posted by wanghd2826 at 2011-08-26 08:56:27:
我提的是昆虫的RNA，应该是过程中降解的太厉害了，但是又找不出到底什么原因，这几天又提了一次，还是不理想，主要是28s降解的太厉害，我把步骤贴出来希望大家看看有什么需要改进的地方。难不成是plus的问题。。 ...

我用的也是宝生物的那个试剂盒提取的，电泳图和你的差不多，降解的很厉害，但操作上我感觉没有什么问题啊，一直都是在超净工作台上提取的，手套口罩不知道换了多少个，实在不明白是怎么回事。我的电泳是100v 20分钟，你跑40分钟太长了吧，呵呵。过几天我打算再提一次看看，唉，加油 顺便长传张我提取的图片给你看看，感觉比你的还差呢
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13楼2011-08-27 22:52:25
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blackrose8089
引用回帖:
10楼: Originally posted by 西瓜 at 2011-08-26 17:25:43:
40 min太久啦！跑胶过程降解是有可能的，我自己碰到过，当时测OD值看着挺好，未有降解的迹象，但是跑胶却拖尾。猜测是跑胶的问题，然后把缓冲液换成新的再跑，就得到很漂亮的图了。
跑胶的主要目的是看有没有降 ...

14楼2011-08-28 10:22:04
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wanghd2826

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 西瓜 at 2011-08-27 21:57:42:
提取过程中降解你是怎么看出来的？
RNA酶-free的EP管和枪头建议还是要买，不会很贵的，用DEPC处理既有潜在的危险，也麻烦，时间也是成本呢。
我现在提RNA几乎不用DEPC了，提取过程中，也就最后一步溶解RNA时用 ...

恩，DEPC确实很麻烦，每次提取都得泡，而且毒性很大...
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15楼2011-08-29 09:29:38
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wanghd2826

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by xuzhu598 at 2011-08-27 22:52:25:
我用的也是宝生物的那个试剂盒提取的，电泳图和你的差不多，降解的很厉害，但操作上我感觉没有什么问题啊，一直都是在超净工作台上提取的，手套口罩不知道换了多少个，实在不明白是怎么回事。我的电泳是100v 20分 ...

我们的电泳仪貌似就是比较慢，只能加大电压来减少时间。可能试剂盒也有关系吧，实在不行就得换试剂盒了。
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16楼2011-08-29 09:34:38
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longage.gene

银虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by xuzhu598 at 2011-08-27 22:52:25:
我用的也是宝生物的那个试剂盒提取的，电泳图和你的差不多，降解的很厉害，但操作上我感觉没有什么问题啊，一直都是在超净工作台上提取的，手套口罩不知道换了多少个，实在不明白是怎么回事。我的电泳是100v 20分 ...

你别在超净台做，会有意想不到的好结果
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17楼2011-08-29 10:08:14
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xuzhu598

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
17楼: Originally posted by longage.gene at 2011-08-29 10:08:14:
你别在超净台做，会有意想不到的好结果

求大神指点？为什么不能在超净工作台提取啊？而且我还打开了通风！
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18楼2011-08-29 12:34:10
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linqin1029

新虫 (初入文坛)
根据你的图发现你提的RNA降解很严重，分析你的实验步骤发现需要改进，改进如下：
1、先在1.5ml离心管+RNAiso plus 1.ml   +RNA酶抑制剂5ul +B-巯基乙醇10ul 混匀待用
2、虫体解剖+液氮研磨
3、研磨后转入1.5ml离心管充分混匀
3、室温静置5min，4度12000rpm离心5min
4、取上清进入新tube，加1/5体积的氯仿（200ul)，震荡混匀
5、室温静置5min，4度12000rpm离心5min
6、取上清进入tube，加入等体积异丙醇，混匀。
7、室温静置10min，4度12000rpm离心10min
8、弃上清，向沉淀中加入1ml 75%冰冻乙醇清洗沉淀，4度12000rpm 离心10min
9、干燥沉淀（干燥放在超菌工作台中进行） 加入20ul DEPC水 取5ul进行电泳（电泳150MA 15MIN)
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19楼2011-08-29 14:09:32
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wanghd2826

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
19楼: Originally posted by linqin1029 at 2011-08-29 14:09:32:
根据你的图发现你提的RNA降解很严重，分析你的实验步骤发现需要改进，改进如下：
1、先在1.5ml离心管+RNAiso plus 1.ml   +RNA酶抑制剂5ul +B-巯基乙醇10ul 混匀待用
2、虫体解剖+液氮研磨
3、研磨后转入1.5ml ...

多谢！ RNAiso 里面用该有RNA酶的抑制剂吧，他是个混合溶液，还需要再加RNA酶和巯基乙醇么？巯基乙醇也是抗氧化剂吧。
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20楼2011-08-31 09:12:18
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