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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 重组质粒构建 连接转化效率低 求帮助啊
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windleakey

金虫 (小有名气)

[求助] 重组质粒构建 连接转化效率低 求帮助啊 已有1人参与

我实验是这样的：

目的基因已经连进了T载体，下面往表达载体（pet28a、pGEX-6p-1）里面连；

首先T载体、表达载体分别双酶切：
dna 15ul、俩酶各 1ul、buffer 5ul 补水至50，切俩小时。各切两管，回收胶（天根的试剂盒）。

图是胶回收完，跑电泳看看回收效果和浓度。分别是目的片段和俩载体；

连接体系：
载体2、目的片段4、Takara的Solution1 6，12ul体系。载体和目的片段比例也尝试过好几种，效果都一样；

转化的感受态是买的，应该不会有什么问题。

最近转化完总是空板，做了4、5次了，有点找不到原因了。希望大神们给点意见。应该是连接这部分有问题。

还有几个小问题：
回收胶洗脱时为什么不用EB呢，天根回收胶试剂盒的EB是不是TB缓冲液啊？
连接不好是不是片段浓度还是有点低呢，比marker亮应该大于20ng/ul了，还需要加大酶切体系多回收些吗？
有人说takara的solution1 效率不好，是吗？

重组质粒构建 连接转化效率低 求帮助啊
IMG_1395.JPG
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1楼 2014-04-02 14:41:32
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

cm8002

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+4, 鼓励回帖交流！ 2014-04-02 21:19:11
1、建议做双酶切的时候降低DNA的量，连接不需要太多，只要确保完全切开；
2、做连接，咱还是别那么省，solution1那是T载体试剂盒里的，做其他连接效率不能保证，建议用takara的T4 DNA连接酶或是其他公司的专用连接酶；
3、“回收胶洗脱时为什么不用Elution Buffer？”可以用，Elution Buffer一般就是tris-hcl 缓冲液，不过要是用于连接的话，还是建议用蒸馏水溶，因为buffer里的盐可能会影响后续的连接步骤。
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windleakey
2楼2014-04-02 21:14:58
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huguangdong

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
windleakey(西门吹雪170代发): 金币+7, 鼓励热心回帖交流 2014-04-06 16:28:21
解答如下：
1 首先检查引物两端酶切位点是否设计正确，有没有失误，尽管从电泳图来看没什么问题，但这是解决问题的第一步。
2 其次，酶切虽然切开了，但是由于你酶切时间过短，你用的那个公司的内切酶效率如何又不知，以我个人经验NEB的内切酶双酶切在4小时以上，TAKARA和MBI的6小时以上，从你的电泳图片来看目的片段切开没问题，但是载体是否之切开了一个酶无法鉴定，所以你要延长酶切事件，尽管你这个实验这方面的原因很小，但是还是要排除。
3 用Solution I 做连接没有问题，本人亲自测试，效率高过T4连接酶，且适合各种连接方式，不仅仅是TA克隆，有问题的是你的连接条件，最佳连接条件是 4 ℃ 24 h，可保证最大限度的连接反应。这个条件是用于各种连接方式，不仅仅是TA，此外体系最好是10ul，目的片段要多，其和载体浓度比在5:1以上，通常我做起来目的片段的浓度如果是100ng/UL，载体40ng/ul。那么就是目的片段4ul，载体1ul，Solution I 5ul。
4 另外，PET28A作为一种低拷贝质粒，转化过程中的感受态细胞要求较高，你是商品化的应该没问题，还有抗性一定要确认好，板子没问题，一些列都排除如果还做不出来，那我也没法子。
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13楼2014-04-05 09:50:50
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普通回帖

windleakey

金虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by cm8002 at 2014-04-02 21:14:58
1、建议做双酶切的时候降低DNA的量，连接不需要太多，只要确保完全切开；
2、做连接，咱还是别那么省，solution1那是T载体试剂盒里的，做其他连接效率不能保证，建议用takara的T4 DNA连接酶或是其他公司的专用连接 ...

谢谢回复，学到很多。
请问，你指的是双酶切体系中减少dna的量哈，那回收片段时dna的量是不是越多越好呢？也就是说连接反应跟连接片段浓度关系大不大？
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3楼2014-04-02 21:31:38
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cm8002

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by windleakey at 2014-04-02 21:31:38
谢谢回复，学到很多。
请问，你指的是双酶切体系中减少dna的量哈，那回收片段时dna的量是不是越多越好呢？也就是说连接反应跟连接片段浓度关系大不大？...

回收片段时dna的量应该是越多越好，多才有的用嘛，但是不是说有多少用多少，是吧，片段浓度对连接反应的影响还是比较大的，所以一般在回收完后都要定量每微升含多少载体和片段，不能单按照含量，得结合片段和载体的大小然后大概估算mol数，再按照3-10：1（大概是这个范围）的比例建立连接体系
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4楼2014-04-03 14:08:05
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pc012351

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
windleakey(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-04-03 19:21:01
切胶回收洗脱用EB没问题的，每次都这么做的，后面照样做酶切做连接，TAKARA的solution1很好用啊，从没出过问题，确认一下酶切完全了没，感受态有没有问题，别人用过没
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5楼2014-04-03 15:12:22
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windleakey

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by pc012351 at 2014-04-03 15:12:22
切胶回收洗脱用EB没问题的，每次都这么做的，后面照样做酶切做连接，TAKARA的solution1很好用啊，从没出过问题，确认一下酶切完全了没，感受态有没有问题，别人用过没

酶切从电泳效果来看，切的还是很彻底的。感受态是买的，转质粒什么的都很正常。
实验只有一涉及连接时，才出问题，总是空板，连个假阳性都没有。
如果不是酶的问题，真的找不到原因了。
买了promega的T4，先试试吧。。。
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6楼2014-04-03 21:18:51
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cs2951819

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你两个酶切位点分别是什么，平端还是黏端，最好去磷酸化一下，1楼说的有道理，但我认为未必是那个原因

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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7楼2014-04-04 07:27:30
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windleakey

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by cs2951819 at 2014-04-04 07:27:30
你两个酶切位点分别是什么，平端还是黏端，最好去磷酸化一下，1楼说的有道理，但我认为未必是那个原因

感谢回复，粘性末端。请问还有可能是什么原因呢
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8楼2014-04-04 15:13:28
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
重新制备平板吧，一个都不长，万一是加错了或者加多了抗生素呢？
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9楼2014-04-04 20:41:12
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windleakey

金虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-04-04 20:41:12
重新制备平板吧，一个都不长，万一是加错了或者加多了抗生素呢？

板子没问题的，因为还用于其它实验呢，比如转化个质粒，连个T载体什么的，实验又没成功，张了俩菌落，还是假阳性，哎
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10楼2014-04-04 23:28:38
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