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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于使载体平末端环化的问题
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气

[求助] 关于使载体平末端环化的问题

嗯...............好久木有冒泡，决定核潜艇上浮一番~
刚好实验也有点问题，想求助各位
具体情况如下：
需要构建一个新载体，想法是从现有载体上直接去除一部分序列就会成为我要的载体，所以采用PCR的方法，反向扩增了这个载体我需要的部分，然后用激酶处理这个线性片段后，想用连接酶环化此片段。
问题出现在：
需要的载体片段约有11kb左右，环化线性片段会非常困难，我试过几次均未成功，看有些资料显示，越长的片段可能形成多聚体的概率会越大。

想问一下是否能有什么添加剂或者方法之类的，促进长片段DNA的自我环化连接呢？
盼高手出现，给予指点。或大家集思广益，共同探讨，共同进步~
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Let God do with it as He wills
1楼2013-07-31 11:06:55
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-07-31 14:08:00
atlanticwi: 金币+10, ★★★很有帮助, 谢谢 gibson assembly应该是个好办法 2013-08-02 12:26:06
如果一定要这么做，可以尝试2000000U/ml的T4ligase或者Blunt/TA Ligase Master Mix之类的。

其实为啥不设计一段overlap呢，然后直接转就行了（就如同定点突变）。   如果BsaI或者同类酶对你的质粒适用，也可以用这种酶切连接完成（产物是没有酶切位点的）
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2楼2013-07-31 12:20:20
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-07-31 22:20:31
另外overlap PCR之后如果怕效率不够高（overlap的方法毕竟有nick，而且），也可以尝试类似gibson assembly的方法吧。。 不过这个我本人没试过，一般直接转效率就很满意了。。
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3楼2013-07-31 12:26:04
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
引用回帖:
3楼: Originally posted by Haibara_Ai at 2013-07-31 12:26:04
另外overlap PCR之后如果怕效率不够高（overlap的方法毕竟有nick，而且），也可以尝试类似gibson assembly的方法吧。。 不过这个我本人没试过，一般直接转效率就很满意了。。

抱歉 我不太明白 若Overlap PCR 我怎么可以形成环化分子？以供我转化？若是用gibson assembly似的方法 我倒可以理解 但这种应该是类似于重组的方式是需要PCR产物两端都有一定的特定序列吧，我的载体只需要去除一部分已有序列，引入特定的序列是不可行的。

高浓度的T4 Ligase我倒是考虑过 但是手上木有现货...................
谢谢指教 希望进一步共同探讨~
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Let God do with it as He wills
4楼2013-07-31 13:20:31
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)
比如AAAAAAAAAAAAAABBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC你不需要B的部分

你PCR时候 f引物  AAAACCCCCCCC
R引物   CCCCAAAAAAAA

这样中间AAAACCCC部分是overlap的。gibson assembly也是一样，特殊序列是你自己定义的，定义成你需要的序列就是了，怎么会引入新的序列。
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5楼2013-07-31 20:34:35
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)
另外提醒一下
如果是AAAAAAAAAAABBBBBBBBBBBBBBBBBBBBCCCCCCCCCCCCCC
用AAAACCCCCCCCCCCCC作引物得话，最好确保AAAA部分退火温度不会太高，
有些聚合酶会在AAAACCCCCCCCCCCCC
   AAAAAAAAAAAAABBBBBBBBBBBBBBBBBBBB
这种Aneal情况下，把引物3‘端mismatch部分切掉，然后开始PCR，就把模板P出来了。。  当然无论怎么样，这种在产物中一般都是少数。
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6楼2013-07-31 20:41:27
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Sthunder

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-07-31 22:21:06
直接PCR环化确实有点难，你首先需要确定你PCR产物确实是平末端，因为很多Taq具有末端家A功能，如果确实是平末端的话，用平末端连接酶进行环化应该没多大问题，注意体系中PCR产物浓度，不要过多。其实最好的方法就是在正、反向引物上设计同一个酶切位点，然后，酶切，连接就好，设计酶切位点的时候注意方向问题！Good luck！
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互助互励，共奋共进！！
7楼2013-07-31 21:18:24
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gyesang

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【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
既然你做了PCR，何不在上下游引物上都设计一个相同的酶切位点，跑完PCR胶回收，然后酶切，自连，类似于单酶切构建载体时的载体自连

你的环化不成功可能原因是你PCR产物磷酸化处理效果不好

我们不是经常将载体去磷酸化来防止载体自连吗？
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8楼2013-07-31 22:23:58
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
引用回帖:
8楼: Originally posted by gyesang at 2013-07-31 22:23:58
既然你做了PCR，何不在上下游引物上都设计一个相同的酶切位点，跑完PCR胶回收，然后酶切，自连，类似于单酶切构建载体时的载体自连

你的环化不成功可能原因是你PCR产物磷酸化处理效果不好

我们不是经常将载体 ...

嗯........
       问题就出在这里，我需要的是去除载体的一段序列，但是不能加入任何一个碱基，因为这个构建好的载体要去做BiFC，加入碱基肯定会有影响。否则的话我是绝对不想玩平端自连的。
       问题肯定不是构建策略上的，因为这样做是我们唯一的办法。是否能够环化我认为才是这个实验中最麻烦的一步。
       PCR产物的磷酸化这个成功与否也比较难以判断。我个人认为即使成功了如此高bp数的DNA还是很难环化自连接的，因为bp数越大，是倾向于分子间连接的......................
       所以呢...........So麻烦呢...................
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Let God do with it as He wills
9楼2013-07-31 23:03:56
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gyesang

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【答案】应助回帖

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atlanticwi: 金币+10, ★★★很有帮助, 嗯 谢谢斑竹的这个建议 2013-08-02 12:26:53
引用回帖:
9楼: Originally posted by atlanticwi at 2013-07-31 23:03:56
嗯........
       问题就出在这里，我需要的是去除载体的一段序列，但是不能加入任何一个碱基，因为这个构建好的载体要去做BiFC，加入碱基肯定会有影响。否则的话我是绝对不想玩平端自连的。
       问题肯定不 ...

你可以低浓度，大体积的连接，这样减少分子间碰撞机会，加大自连概率
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10楼2013-08-01 00:36:58
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