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atlanticwi金虫 (正式写手)
琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
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[求助]
关于使载体平末端环化的问题
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嗯...............好久木有冒泡，决定核潜艇上浮一番~ 刚好实验也有点问题，想求助各位 具体情况如下： 需要构建一个新载体，想法是从现有载体上直接去除一部分序列就会成为我要的载体，所以采用PCR的方法，反向扩增了这个载体我需要的部分，然后用激酶处理这个线性片段后，想用连接酶环化此片段。 问题出现在： 需要的载体片段约有11kb左右，环化线性片段会非常困难，我试过几次均未成功，看有些资料显示，越长的片段可能形成多聚体的概率会越大。 想问一下是否能有什么添加剂或者方法之类的，促进长片段DNA的自我环化连接呢？ 盼高手出现，给予指点。或大家集思广益，共同探讨，共同进步~ |
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atlanticwi
金虫 (正式写手)
琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
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4楼2013-07-31 13:20:31
【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-07-31 14:08:00
atlanticwi: 金币+10, ★★★很有帮助, 谢谢 gibson assembly应该是个好办法 2013-08-02 12:26:06
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如果一定要这么做，可以尝试2000000U/ml的T4ligase或者Blunt/TA Ligase Master Mix之类的。 其实为啥不设计一段overlap呢，然后直接转就行了（就如同定点突变）。 如果BsaI或者同类酶对你的质粒适用，也可以用这种酶切连接完成（产物是没有酶切位点的） |
2楼2013-07-31 12:20:20
3楼2013-07-31 12:26:04
5楼2013-07-31 20:34:35
40