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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于使载体平末端环化的问题
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by atlanticwi at 2013-07-31 23:03:56
嗯........
       问题就出在这里，我需要的是去除载体的一段序列，但是不能加入任何一个碱基，因为这个构建好的载体要去做BiFC，加入碱基肯定会有影响。否则的话我是绝对不想玩平端自连的。
       问题肯定不 ...

根本不是唯一的办法，现在不加碱基的方法多了去了，
CPEC gibson  goldengate  你随便选一个设计下就是了，
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11楼2013-08-01 02:58:25
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by gyesang at 2013-08-01 00:36:58
你可以低浓度，大体积的连接，这样减少分子间碰撞机会，加大自连概率...

没必要低浓度，就算多origin的linearDNA（当然transformation效率低，不过可以electroporation），在ecoli里面也有很大机会通过recombination成为单一环。

不过无论如何我觉得用LZ方法如果没有在其他情况下试验过你的每一步都可行的话（比如你弄个小点的质粒确认下你的磷酸化酶和T4效率都可以这么连），只能自求多福。
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12楼2013-08-01 03:02:26
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)
Polyethylene glycol (PEG) greatly increases the ligation
efficiency of blunt-end DNA ligation. The recommended
concentration of PEG 4000 in the ligation reaction
mixture is 5% (w/v).

在NEB的blunt end kit里面也加了PEG，不过在PEG存在情况下，长时间（overnight）的ligation会降低效率。11Kbelectroporation可以提高效率，不过PEG和ligase都会严重影响，所以要用得话需要做一次额外的cleanup（ddH2O洗脱）

1. Glycerol 20% Cas.# 56-81-5
2. PEG-6000 13.6% Cas.# 25322-68-3
3. Proprietary Information 10%
4. Tris-HCl 1.5% Cas.# 77-86-1
这是NEB的快速blunt end kit成分，10%不知道。。
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13楼2013-08-01 03:20:23
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m_marion

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
13楼: Originally posted by Haibara_Ai at 2013-08-01 03:20:23
Polyethylene glycol (PEG) greatly increases the ligation
efficiency of blunt-end DNA ligation. The recommended
concentration of PEG 4000 in the ligation reaction
mixture is 5% (w/v).

在NEB的 ...

PEG 是自环化连接反应的标准添加剂，但是对于这么大的质粒效果并不明显，我用电泳的办法测试过。
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14楼2013-08-01 04:39:41
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睿智的锐志

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
看你的工作计划，如果太紧不想是其他，那就赌运气。
如果时间不紧，放弃原来的想法，重新设计工作路线。否则试来试去时间更费。
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15楼2013-08-01 15:45:04
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