应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于使载体平末端环化的问题
152/2返回列表上一页12
查看: 4864  |  回复: 14
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by atlanticwi at 2013-07-31 23:03:56
嗯........
       问题就出在这里，我需要的是去除载体的一段序列，但是不能加入任何一个碱基，因为这个构建好的载体要去做BiFC，加入碱基肯定会有影响。否则的话我是绝对不想玩平端自连的。
       问题肯定不 ...

根本不是唯一的办法，现在不加碱基的方法多了去了，
CPEC gibson  goldengate  你随便选一个设计下就是了，
赞一下 回复此楼
11楼2013-08-01 02:58:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by gyesang at 2013-08-01 00:36:58
你可以低浓度，大体积的连接，这样减少分子间碰撞机会，加大自连概率...

没必要低浓度，就算多origin的linearDNA（当然transformation效率低，不过可以electroporation），在ecoli里面也有很大机会通过recombination成为单一环。

不过无论如何我觉得用LZ方法如果没有在其他情况下试验过你的每一步都可行的话（比如你弄个小点的质粒确认下你的磷酸化酶和T4效率都可以这么连），只能自求多福。
赞一下 回复此楼
12楼2013-08-01 03:02:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)
Polyethylene glycol (PEG) greatly increases the ligation
efficiency of blunt-end DNA ligation. The recommended
concentration of PEG 4000 in the ligation reaction
mixture is 5% (w/v).

在NEB的blunt end kit里面也加了PEG，不过在PEG存在情况下，长时间（overnight）的ligation会降低效率。11Kbelectroporation可以提高效率，不过PEG和ligase都会严重影响，所以要用得话需要做一次额外的cleanup（ddH2O洗脱）

1. Glycerol 20% Cas.# 56-81-5
2. PEG-6000 13.6% Cas.# 25322-68-3
3. Proprietary Information 10%
4. Tris-HCl 1.5% Cas.# 77-86-1
这是NEB的快速blunt end kit成分，10%不知道。。
赞一下 回复此楼
13楼2013-08-01 03:20:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

m_marion

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
13楼: Originally posted by Haibara_Ai at 2013-08-01 03:20:23
Polyethylene glycol (PEG) greatly increases the ligation
efficiency of blunt-end DNA ligation. The recommended
concentration of PEG 4000 in the ligation reaction
mixture is 5% (w/v).

在NEB的 ...

PEG 是自环化连接反应的标准添加剂，但是对于这么大的质粒效果并不明显，我用电泳的办法测试过。
赞一下 回复此楼
14楼2013-08-01 04:39:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

睿智的锐志

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
看你的工作计划，如果太紧不想是其他，那就赌运气。
如果时间不紧，放弃原来的想法，重新设计工作路线。否则试来试去时间更费。
赞一下 回复此楼
15楼2013-08-01 15:45:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 atlanticwi 的主题更新
152/2返回列表上一页12
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +4 FChKX8meu1ds 2026-11-09 9/450 2026-11-11 04:54 by Z7qfCsdIiD1T
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 FChKX8meu1ds 2026-11-09 6/300 2026-11-11 04:32 by Z7qfCsdIiD1T
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 FChKX8meu1ds 2026-11-09 5/250 2026-11-11 04:29 by Z7qfCsdIiD1T
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 0TEMgxdT1eIw 2026-11-09 6/300 2026-11-11 04:10 by Z7qfCsdIiD1T
[硕博家园] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +4 0TEMgxdT1eIw 2026-11-09 6/300 2026-11-11 04:07 by Z7qfCsdIiD1T
[公派出国] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 zSbvVX9JFl9J 2026-11-09 5/250 2026-11-11 04:01 by Z7qfCsdIiD1T
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 FChKX8meu1ds 2026-11-09 6/300 2026-11-11 01:32 by Z7qfCsdIiD1T
[考研] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +4 0TEMgxdT1eIw 2026-11-09 6/300 2026-11-11 01:10 by Z7qfCsdIiD1T
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +4 cqv1zKnzd7hr 2026-11-09 5/250 2026-11-10 20:45 by Z7qfCsdIiD1T
[硕博家园] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 cqv1zKnzd7hr 2026-11-09 4/200 2026-11-10 20:07 by Z7qfCsdIiD1T
[考博] 申请环境，微生物方向博士 +3 浅笑09 2026-11-08 3/150 2026-11-10 12:44 by 可淡不可忘
[教师之家] 延安大学回应“副教授留绝笔信”：确已离世，正核实举报内容 +4 yexuqing 2026-11-04 6/300 2026-11-10 11:13 by susizheng
[考博] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 zSbvVX9JFl9J 2026-11-09 4/200 2026-11-10 01:29 by FChKX8meu1ds
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +5 kvewwGtKktqB 2026-11-04 12/600 2026-11-09 13:26 by Equinoxhua
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +3 5sJFDKp2kwuI 2026-11-06 12/600 2026-11-09 06:32 by l48hFd8Nwae2
[公派出国] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +4 5sJFDKp2kwuI 2026-11-06 8/400 2026-11-09 00:14 by l48hFd8Nwae2
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 5sJFDKp2kwuI 2026-11-06 8/400 2026-11-08 23:01 by l48hFd8Nwae2
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +5 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 10/500 2026-11-06 16:12 by 5sJFDKp2kwuI
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +4 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 11/550 2026-11-06 16:10 by 5sJFDKp2kwuI
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +6 kvewwGtKktqB 2026-11-04 16/800 2026-11-06 05:00 by qL1cU46YIdK0
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭