应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于使载体平末端环化的问题
52/1返回列表
查看: 4665  |  回复: 14
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气

[求助] 关于使载体平末端环化的问题

嗯...............好久木有冒泡，决定核潜艇上浮一番~
刚好实验也有点问题，想求助各位
具体情况如下：
需要构建一个新载体，想法是从现有载体上直接去除一部分序列就会成为我要的载体，所以采用PCR的方法，反向扩增了这个载体我需要的部分，然后用激酶处理这个线性片段后，想用连接酶环化此片段。
问题出现在：
需要的载体片段约有11kb左右，环化线性片段会非常困难，我试过几次均未成功，看有些资料显示，越长的片段可能形成多聚体的概率会越大。

想问一下是否能有什么添加剂或者方法之类的，促进长片段DNA的自我环化连接呢？
盼高手出现，给予指点。或大家集思广益，共同探讨，共同进步~
回复此楼

» 猜你喜欢
Let God do with it as He wills
1楼 2013-07-31 11:06:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by atlanticwi at 2013-07-31 23:03:56
嗯........
       问题就出在这里，我需要的是去除载体的一段序列，但是不能加入任何一个碱基，因为这个构建好的载体要去做BiFC，加入碱基肯定会有影响。否则的话我是绝对不想玩平端自连的。
       问题肯定不 ...

根本不是唯一的办法，现在不加碱基的方法多了去了，
CPEC gibson  goldengate  你随便选一个设计下就是了，
赞一下 回复此楼
11楼2013-08-01 02:58:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 15 个回答

Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-07-31 14:08:00
atlanticwi: 金币+10, ★★★很有帮助, 谢谢 gibson assembly应该是个好办法 2013-08-02 12:26:06
如果一定要这么做，可以尝试2000000U/ml的T4ligase或者Blunt/TA Ligase Master Mix之类的。

其实为啥不设计一段overlap呢，然后直接转就行了（就如同定点突变）。   如果BsaI或者同类酶对你的质粒适用，也可以用这种酶切连接完成（产物是没有酶切位点的）
赞一下 回复此楼
2楼2013-07-31 12:20:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-07-31 22:20:31
另外overlap PCR之后如果怕效率不够高（overlap的方法毕竟有nick，而且），也可以尝试类似gibson assembly的方法吧。。 不过这个我本人没试过，一般直接转效率就很满意了。。
赞一下 回复此楼
3楼2013-07-31 12:26:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
引用回帖:
3楼: Originally posted by Haibara_Ai at 2013-07-31 12:26:04
另外overlap PCR之后如果怕效率不够高（overlap的方法毕竟有nick，而且），也可以尝试类似gibson assembly的方法吧。。 不过这个我本人没试过，一般直接转效率就很满意了。。

抱歉 我不太明白 若Overlap PCR 我怎么可以形成环化分子？以供我转化？若是用gibson assembly似的方法 我倒可以理解 但这种应该是类似于重组的方式是需要PCR产物两端都有一定的特定序列吧，我的载体只需要去除一部分已有序列，引入特定的序列是不可行的。

高浓度的T4 Ligase我倒是考虑过 但是手上木有现货...................
谢谢指教 希望进一步共同探讨~
赞一下 回复此楼
Let God do with it as He wills
4楼2013-07-31 13:20:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 15 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 2026年的国家社科基金项目通讯评审的新规则与新动向、新挑战 +3 process2012 2026-08-23 4/200 2026-08-23 12:54 by huixian257
[教师之家] 跳槽后在研项目怎么办？ +5 简单化xn 2026-08-22 10/500 2026-08-23 12:38 by 简单化xn
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 h4CP7TrQR8Lg 2026-08-22 5/250 2026-08-23 12:09 by LR9qGULyN2ew
[基金申请] 什么时候开奖？ +9 CrisMessi 2026-08-18 10/500 2026-08-23 12:03 by 丶昵称占用
[基金申请] 让我中一个面上吧！ +12 大萍1987 2026-08-20 14/700 2026-08-23 10:30 by wrm
[基金申请] 今天放榜吗？ +15 布布和一二 2026-08-19 16/800 2026-08-23 09:55 by 张春生
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 2JOx3r2CYEgw 2026-08-22 5/250 2026-08-23 07:41 by OEbVnUOu01ol
[博后之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 DpSrDtM079iu 2026-08-22 5/250 2026-08-23 04:07 by OEbVnUOu01ol
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 2JOx3r2CYEgw 2026-08-22 6/300 2026-08-23 03:40 by OEbVnUOu01ol
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 QTy3jDtz1uLt 2026-08-21 9/450 2026-08-23 03:04 by OEbVnUOu01ol
[基金申请] 93BebMhtakh前后11位开头都是大写 +7 且听虎啸 2026-08-17 8/400 2026-08-22 21:55 by 医学老男孩
[基金申请] 人气不行了 +8 fansofjerry 2026-08-21 8/400 2026-08-22 16:30 by zyqchem
[基金申请] 今天基金会出结果吗？20260819 +16 kkkl_v 2026-08-19 17/850 2026-08-22 16:12 by 阿布Abu
[基金申请] 放榜前的不淡定 40+4 snowwithsea 2026-08-19 14/700 2026-08-21 23:51 by cratir
[基金申请] 建议基金发布提前给出明确的时间点 +10 kulium 2026-08-21 13/650 2026-08-21 21:58 by alongwaytogo
[基金申请] 今日不放榜？网传国自然预计 8 月 27 日可查结果 +16 医学老男孩 2026-08-20 20/1000 2026-08-21 21:13 by Ldrop2023
[基金申请] 科研孤儿太难了 +17 我4大白菜 2026-08-20 18/900 2026-08-21 20:57 by zhangev
[基金申请] 应该是下周三26日公布了吧？ +4 哈哈蛤？ 2026-08-21 4/200 2026-08-21 10:58 by Vivilian
[论文投稿] 投稿咨询 +5 wwm09 2026-08-17 7/350 2026-08-21 10:11 by 期刊论文帮手
[基金申请] 今天系统多次维护，明天很可能放榜！ +10 zju2000 2026-08-16 11/550 2026-08-20 20:02 by cl479861084
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭