应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于使载体平末端环化的问题
51/1返回列表
查看: 4386  |  回复: 14
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气

[求助] 关于使载体平末端环化的问题

嗯...............好久木有冒泡，决定核潜艇上浮一番~
刚好实验也有点问题，想求助各位
具体情况如下：
需要构建一个新载体，想法是从现有载体上直接去除一部分序列就会成为我要的载体，所以采用PCR的方法，反向扩增了这个载体我需要的部分，然后用激酶处理这个线性片段后，想用连接酶环化此片段。
问题出现在：
需要的载体片段约有11kb左右，环化线性片段会非常困难，我试过几次均未成功，看有些资料显示，越长的片段可能形成多聚体的概率会越大。

想问一下是否能有什么添加剂或者方法之类的，促进长片段DNA的自我环化连接呢？
盼高手出现，给予指点。或大家集思广益，共同探讨，共同进步~
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
Let God do with it as He wills
1楼 2013-07-31 11:06:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
引用回帖:
8楼: Originally posted by gyesang at 2013-07-31 22:23:58
既然你做了PCR，何不在上下游引物上都设计一个相同的酶切位点，跑完PCR胶回收，然后酶切，自连，类似于单酶切构建载体时的载体自连

你的环化不成功可能原因是你PCR产物磷酸化处理效果不好

我们不是经常将载体 ...

嗯........
       问题就出在这里，我需要的是去除载体的一段序列，但是不能加入任何一个碱基，因为这个构建好的载体要去做BiFC，加入碱基肯定会有影响。否则的话我是绝对不想玩平端自连的。
       问题肯定不是构建策略上的，因为这样做是我们唯一的办法。是否能够环化我认为才是这个实验中最麻烦的一步。
       PCR产物的磷酸化这个成功与否也比较难以判断。我个人认为即使成功了如此高bp数的DNA还是很难环化自连接的，因为bp数越大，是倾向于分子间连接的......................
       所以呢...........So麻烦呢...................
赞一下 回复此楼
Let God do with it as He wills
9楼2013-07-31 23:03:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 15 个回答

Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-07-31 14:08:00
atlanticwi: 金币+10, ★★★很有帮助, 谢谢 gibson assembly应该是个好办法 2013-08-02 12:26:06
如果一定要这么做，可以尝试2000000U/ml的T4ligase或者Blunt/TA Ligase Master Mix之类的。

其实为啥不设计一段overlap呢，然后直接转就行了（就如同定点突变）。   如果BsaI或者同类酶对你的质粒适用，也可以用这种酶切连接完成（产物是没有酶切位点的）
赞一下 回复此楼
2楼2013-07-31 12:20:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-07-31 22:20:31
另外overlap PCR之后如果怕效率不够高（overlap的方法毕竟有nick，而且），也可以尝试类似gibson assembly的方法吧。。 不过这个我本人没试过，一般直接转效率就很满意了。。
赞一下 回复此楼
3楼2013-07-31 12:26:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
引用回帖:
3楼: Originally posted by Haibara_Ai at 2013-07-31 12:26:04
另外overlap PCR之后如果怕效率不够高（overlap的方法毕竟有nick，而且），也可以尝试类似gibson assembly的方法吧。。 不过这个我本人没试过，一般直接转效率就很满意了。。

抱歉 我不太明白 若Overlap PCR 我怎么可以形成环化分子？以供我转化？若是用gibson assembly似的方法 我倒可以理解 但这种应该是类似于重组的方式是需要PCR产物两端都有一定的特定序列吧，我的载体只需要去除一部分已有序列，引入特定的序列是不可行的。

高浓度的T4 Ligase我倒是考虑过 但是手上木有现货...................
谢谢指教 希望进一步共同探讨~
赞一下 回复此楼
Let God do with it as He wills
4楼2013-07-31 13:20:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 15 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 294求调剂材料与化工专硕 +5 陌の森林 2026-03-18 5/250 2026-03-18 22:18 by bingxueer79
[考研] 一志愿天津大学化学工艺专业（081702）315分求调剂 +10 yangfz 2026-03-17 10/500 2026-03-18 20:14 by walc
[考研] 344求调剂 +6 knight344 2026-03-16 7/350 2026-03-18 20:13 by walc
[考研] 070303一志愿西北大学学硕310找调剂 +6 d如愿上岸 2026-03-12 9/450 2026-03-18 19:50 by macy2011
[考研] 0703化学调剂 +7 妮妮ninicgb 2026-03-15 11/550 2026-03-18 19:48 by macy2011
[考研] 0703化学 305求调剂 +3 FY_yy 2026-03-14 3/150 2026-03-18 19:40 by macy2011
[考研] 295求调剂 +3 一志愿京区211 2026-03-18 5/250 2026-03-18 17:03 by zhaoqian0518
[考研] 286求调剂 +6 lemonzzn 2026-03-16 9/450 2026-03-18 15:31 by vgtyfty
[考研] 311求调剂 +6 26研0 2026-03-15 6/300 2026-03-18 14:43 by haxia
[考研] 288求调剂，一志愿华南理工大学071005 +4 ioodiiij 2026-03-17 4/200 2026-03-18 12:36 by Linda Hu
[考研] 0703化学调剂 +3 妮妮ninicgb 2026-03-17 3/150 2026-03-18 10:29 by macy2011
[考研] 301求调剂 +9 yy要上岸呀 2026-03-17 9/450 2026-03-18 08:58 by 无际的草原
[考研] 293求调剂 +11 zjl的号 2026-03-16 16/800 2026-03-18 08:10 by zhukairuo
[考研] 275求调剂 +4 太阳花天天开心 2026-03-16 4/200 2026-03-17 10:53 by 功夫疯狂
[考研] 一志愿211 0703方向310分求调剂 +3 努力奋斗112 2026-03-15 3/150 2026-03-16 16:44 by houyaoxu
[考研] 0856专硕279求调剂 +5 加油加油！? 2026-03-15 5/250 2026-03-15 11:58 by 2020015
[考研] 085601材料工程315分求调剂 +3 yang_0104 2026-03-15 3/150 2026-03-15 10:58 by peike
[考研] 328求调剂 +3 5201314Lsy！ 2026-03-13 6/300 2026-03-14 15:31 by hyswxzs
[考研] 求调剂 +5 一定有学上- 2026-03-12 5/250 2026-03-13 18:31 by ms629
[考研] 一志愿211化学学硕310分求调剂 +8 努力奋斗112 2026-03-12 9/450 2026-03-13 15:41 by JourneyLucky
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭