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无敌小莫

铜虫 (小有名气)

[求助] 求助,酶切之后,非但是没有产物,而且连原本的质粒也没跑出来 已有1人参与

酶切之后,非但是没有产物,而且连原本的质粒也没跑出来。我用得世PET32a质粒做双酶切,体系为10*buffer tango  10微升 BamhI 2微升 X—hol 2微升 质粒 36微升。之前提了4管32a质粒,琼脂糖凝胶电泳跑胶都有非常明显的条带,可是经过37度6小时的双酶切之后,再去跑胶发现32a质粒也不见了。但是marker还是跑的很清晰,另外,我还同时做了PigC基因的双酶切也是37度切了6个小时,但是却跑出了比较暗的条带,这是和32a双酶切后质粒一起跑的,好纠结,做了两个月了,已经出现好对此32a质粒酶切之后就不见了,有时候经过纯化试剂盒纯化之后也会没有,郁闷了.....求各位大神指点,小子本科生,实在是经验少。。。求指点,金币也只有这么点,各位别嫌少啊
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新人小玥

木虫 (正式写手)

能上个图来看看么?没了指的是泳道完全黑的,还是全部弥散?
2楼2014-02-27 22:34:49
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无敌小莫

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 新人小玥 at 2014-02-27 22:34:49
能上个图来看看么?没了指的是泳道完全黑的,还是全部弥散?

是这样的,学校仪器不怎么好使,当时U盘插进去也没反应,我精确描述给你,PigC在将近3000bp处有暗条带,这个看起来还是很明显的,因为周围都很暗。而32a质粒则全部都是黑的。但是在胶的最尽头却是都有相当一大片的模糊亮影,和上述PigC的条带两度是一致的。32a是5000bp以上的质粒。
3楼2014-02-27 22:51:27
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新人小玥

木虫 (正式写手)

★ ★ ★
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-02-28 11:50:12
引用回帖:
3楼: Originally posted by 无敌小莫 at 2014-02-27 22:51:27
是这样的,学校仪器不怎么好使,当时U盘插进去也没反应,我精确描述给你,PigC在将近3000bp处有暗条带,这个看起来还是很明显的,因为周围都很暗。而32a质粒则全部都是黑的。但是在胶的最尽头却是都有相当一大片的 ...

胶的尽头指的是梳孔处还是跑的底部?要是底部的话,说明全部切碎了。要不就是您的质粒里存在大量的BamH I的位点,要不就是酶切反应中有其它污染。如果是梳孔处,则说明完全没切开,可能是质粒提取的质量不高,影响了酶切。
4楼2014-02-27 23:02:06
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无敌小莫

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 新人小玥 at 2014-02-27 23:02:06
胶的尽头指的是梳孔处还是跑的底部?要是底部的话,说明全部切碎了。要不就是您的质粒里存在大量的BamH I的位点,要不就是酶切反应中有其它污染。如果是梳孔处,则说明完全没切开,可能是质粒提取的质量不高,影响 ...

胶不是有打样孔吗,我说的胶的尽头指的不是打样孔那一边,这个东西已经搞了两个多月了,寒假之前也在搞,我的组员都不乐意做了,我也是没办法。。。
5楼2014-02-27 23:06:54
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无敌小莫

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 新人小玥 at 2014-02-27 23:02:06
胶的尽头指的是梳孔处还是跑的底部?要是底部的话,说明全部切碎了。要不就是您的质粒里存在大量的BamH I的位点,要不就是酶切反应中有其它污染。如果是梳孔处,则说明完全没切开,可能是质粒提取的质量不高,影响 ...

也许是污染了吧  真纠结 马上要考研了,这个构建菌不知道还要多久
6楼2014-02-27 23:09:46
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新人小玥

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-02-28 11:50:19
引用回帖:
5楼: Originally posted by 无敌小莫 at 2014-02-27 23:06:54
胶不是有打样孔吗,我说的胶的尽头指的不是打样孔那一边,这个东西已经搞了两个多月了,寒假之前也在搞,我的组员都不乐意做了,我也是没办法。。。...

告诉老板,买新酶,这个用不了多少钱。还有就是你提质粒时候严格按照试剂盒来,洗干净点,最后一步一定不要有乙醇残留,而且不能吹得太干。加油!
7楼2014-02-27 23:14:37
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