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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助，酶切之后，非但是没有产物，而且连原本的质粒也没跑出来
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无敌小莫

铜虫 (小有名气)

[求助] 求助，酶切之后，非但是没有产物，而且连原本的质粒也没跑出来 已有1人参与

酶切之后，非但是没有产物，而且连原本的质粒也没跑出来。我用得世PET32a质粒做双酶切，体系为10*buffer tango  10微升 BamhI 2微升 X—hol 2微升 质粒 36微升。之前提了4管32a质粒，琼脂糖凝胶电泳跑胶都有非常明显的条带，可是经过37度6小时的双酶切之后，再去跑胶发现32a质粒也不见了。但是marker还是跑的很清晰，另外，我还同时做了PigC基因的双酶切也是37度切了6个小时，但是却跑出了比较暗的条带，这是和32a双酶切后质粒一起跑的，好纠结，做了两个月了，已经出现好对此32a质粒酶切之后就不见了，有时候经过纯化试剂盒纯化之后也会没有，郁闷了.....求各位大神指点，小子本科生，实在是经验少。。。求指点，金币也只有这么点，各位别嫌少啊
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1楼 2014-02-27 21:57:03
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新人小玥

木虫 (正式写手)
能上个图来看看么？没了指的是泳道完全黑的，还是全部弥散？
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2楼2014-02-27 22:34:49
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无敌小莫

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 新人小玥 at 2014-02-27 22:34:49
能上个图来看看么？没了指的是泳道完全黑的，还是全部弥散？

是这样的，学校仪器不怎么好使，当时U盘插进去也没反应，我精确描述给你，PigC在将近3000bp处有暗条带，这个看起来还是很明显的，因为周围都很暗。而32a质粒则全部都是黑的。但是在胶的最尽头却是都有相当一大片的模糊亮影，和上述PigC的条带两度是一致的。32a是5000bp以上的质粒。
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3楼2014-02-27 22:51:27
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新人小玥

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-02-28 11:50:12
引用回帖:
3楼: Originally posted by 无敌小莫 at 2014-02-27 22:51:27
是这样的，学校仪器不怎么好使，当时U盘插进去也没反应，我精确描述给你，PigC在将近3000bp处有暗条带，这个看起来还是很明显的，因为周围都很暗。而32a质粒则全部都是黑的。但是在胶的最尽头却是都有相当一大片的 ...

胶的尽头指的是梳孔处还是跑的底部？要是底部的话，说明全部切碎了。要不就是您的质粒里存在大量的BamH I的位点，要不就是酶切反应中有其它污染。如果是梳孔处，则说明完全没切开，可能是质粒提取的质量不高，影响了酶切。
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4楼2014-02-27 23:02:06
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无敌小莫

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 新人小玥 at 2014-02-27 23:02:06
胶的尽头指的是梳孔处还是跑的底部？要是底部的话，说明全部切碎了。要不就是您的质粒里存在大量的BamH I的位点，要不就是酶切反应中有其它污染。如果是梳孔处，则说明完全没切开，可能是质粒提取的质量不高，影响 ...

胶不是有打样孔吗，我说的胶的尽头指的不是打样孔那一边，这个东西已经搞了两个多月了，寒假之前也在搞，我的组员都不乐意做了，我也是没办法。。。
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5楼2014-02-27 23:06:54
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无敌小莫

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 新人小玥 at 2014-02-27 23:02:06
胶的尽头指的是梳孔处还是跑的底部？要是底部的话，说明全部切碎了。要不就是您的质粒里存在大量的BamH I的位点，要不就是酶切反应中有其它污染。如果是梳孔处，则说明完全没切开，可能是质粒提取的质量不高，影响 ...

也许是污染了吧  真纠结 马上要考研了，这个构建菌不知道还要多久
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6楼2014-02-27 23:09:46
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新人小玥

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-02-28 11:50:19
引用回帖:
5楼: Originally posted by 无敌小莫 at 2014-02-27 23:06:54
胶不是有打样孔吗，我说的胶的尽头指的不是打样孔那一边，这个东西已经搞了两个多月了，寒假之前也在搞，我的组员都不乐意做了，我也是没办法。。。...

告诉老板，买新酶，这个用不了多少钱。还有就是你提质粒时候严格按照试剂盒来，洗干净点，最后一步一定不要有乙醇残留，而且不能吹得太干。加油！
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7楼2014-02-27 23:14:37
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