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windleakey金虫 (小有名气)
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[求助]
重组质粒构建 连接转化效率低 求帮助啊已有1人参与
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我实验是这样的： 目的基因已经连进了T载体，下面往表达载体（pet28a、pGEX-6p-1）里面连； 首先T载体、表达载体分别双酶切： dna 15ul、俩酶各 1ul、buffer 5ul 补水至50，切俩小时。各切两管，回收胶（天根的试剂盒）。 图是胶回收完，跑电泳看看回收效果和浓度。分别是目的片段和俩载体； 连接体系： 载体2、目的片段4、Takara的Solution1 6，12ul体系。载体和目的片段比例也尝试过好几种，效果都一样； 转化的感受态是买的，应该不会有什么问题。 最近转化完总是空板，做了4、5次了，有点找不到原因了。希望大神们给点意见。应该是连接这部分有问题。 还有几个小问题： 回收胶洗脱时为什么不用EB呢，天根回收胶试剂盒的EB是不是TB缓冲液啊？ 连接不好是不是片段浓度还是有点低呢，比marker亮应该大于20ng/ul了，还需要加大酶切体系多回收些吗？ 有人说takara的solution1 效率不好，是吗？  IMG_1395.JPG |
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huguangdong
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【答案】应助回帖
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windleakey(西门吹雪170代发): 金币+7, 鼓励热心回帖交流 2014-04-06 16:28:21
windleakey(西门吹雪170代发): 金币+7, 鼓励热心回帖交流 2014-04-06 16:28:21
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解答如下： 1 首先检查引物两端酶切位点是否设计正确，有没有失误，尽管从电泳图来看没什么问题，但这是解决问题的第一步。 2 其次，酶切虽然切开了，但是由于你酶切时间过短，你用的那个公司的内切酶效率如何又不知，以我个人经验NEB的内切酶双酶切在4小时以上，TAKARA和MBI的6小时以上，从你的电泳图片来看目的片段切开没问题，但是载体是否之切开了一个酶无法鉴定，所以你要延长酶切事件，尽管你这个实验这方面的原因很小，但是还是要排除。 3 用Solution I 做连接没有问题，本人亲自测试，效率高过T4连接酶，且适合各种连接方式，不仅仅是TA克隆，有问题的是你的连接条件，最佳连接条件是 4 ℃ 24 h，可保证最大限度的连接反应。这个条件是用于各种连接方式，不仅仅是TA，此外体系最好是10ul，目的片段要多，其和载体浓度比在5:1以上，通常我做起来目的片段的浓度如果是100ng/UL，载体40ng/ul。那么就是目的片段4ul，载体1ul，Solution I 5ul。 4 另外，PET28A作为一种低拷贝质粒，转化过程中的感受态细胞要求较高，你是商品化的应该没问题，还有抗性一定要确认好，板子没问题，一些列都排除如果还做不出来，那我也没法子。 |
13楼2014-04-05 09:50:50
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+4, 鼓励回帖交流！ 2014-04-02 21:19:11
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1、建议做双酶切的时候降低DNA的量，连接不需要太多，只要确保完全切开； 2、做连接，咱还是别那么省，solution1那是T载体试剂盒里的，做其他连接效率不能保证，建议用takara的T4 DNA连接酶或是其他公司的专用连接酶； 3、“回收胶洗脱时为什么不用Elution Buffer？”可以用，Elution Buffer一般就是tris-hcl 缓冲液，不过要是用于连接的话，还是建议用蒸馏水溶，因为buffer里的盐可能会影响后续的连接步骤。 |
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windleakey2楼2014-04-02 21:14:58
windleakey
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4楼2014-04-03 14:08:05