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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 质粒与片段的连接
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lly198784

木虫 (正式写手)

[求助] 质粒与片段的连接

我最近在构建一个重组质粒，因为酶切位点只剩下XbaI可以选择，所以只能XbaI单连，用此酶单酶切空质粒是切出一条很亮的条带的，然后去磷酸化后与酶切后的片段按照摩尔比1：3，1:5,1:10进行了10微升和16微升的连接体系用快速连接酶solution I连接了5个小时，但是做了好几次，结果都是无任何克隆长出，质粒大小是5809bp， 片段是5399 bp，是不是因为两个都太长且比较相近所以很难连接吗？我之前用同样的XbaI单连另外一个载体是成功的，但是那个重组质粒总长7000多bp。请懂的大侠们支招啊？做了一个月了，感觉很失败啊，以前我构建都是一次性或者两次就成功的。
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1楼 2013-04-25 14:30:02
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娟儿要踏实

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励发贴交流，为楼主问题解决提供可能的线索！ 2013-04-26 14:41:37
lly198784: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-06-24 11:02:11
可能就是你的插入片段太大，连接不上，也可能是你已经连接上去，但是转化效果不好，建议你可以采用其他的转化方法试试。或者更换质粒。
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2楼2013-04-26 10:52:54
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senix

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lly198784: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-06-24 11:02:21
插入片段和载体一样大小，调整1：1进行。
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做实验就是和上帝玩游戏！
3楼2013-04-26 19:06:13
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wangxin320

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
lly198784: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-06-24 11:02:29
建议使用T4连接酶进行大片段的连接，连接效率要高些
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4楼2013-05-03 15:09:21
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意孤城_

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
lly198784: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-06-24 11:02:35
只要对载体或者片段一个进行去磷酸化（最好选择有抗性标签的载体骨架去磷酸化），这样可以保证减少其中一个自连，这样也许会好点。
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5楼2013-05-03 16:38:30
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
lly198784: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-06-24 11:02:40
为什么不用PCR克隆呢？
效率绝对比酶切连接高。
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生物资源交流QQ群：1044518333
6楼2013-05-03 22:02:37
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lly198784

木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by snoopyzxx at 2013-05-03 22:02:37
为什么不用PCR克隆呢？
效率绝对比酶切连接高。

PCR克隆是什么？
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7楼2013-06-24 11:02:54
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lly198784

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by senix at 2013-04-26 19:06:13
插入片段和载体一样大小，调整1：1进行。

试了1:1也不行
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8楼2013-06-24 11:04:33
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lly198784

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by wangxin320 at 2013-05-03 15:09:21
建议使用T4连接酶进行大片段的连接，连接效率要高些

好的，我试一下
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9楼2013-06-24 11:04:52
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lly198784

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 意孤城_ at 2013-05-03 16:38:30
只要对载体或者片段一个进行去磷酸化（最好选择有抗性标签的载体骨架去磷酸化），这样可以保证减少其中一个自连，这样也许会好点。

对载体进行了去磷酸化
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10楼2013-06-24 11:05:16
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