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[求助] ApaI酶切位点保护碱基

求问ApaI酶切位点的保护碱基是什么？我之前做一个质粒和片段的连接，构建载体，酶切酶连后还是转化不出来。是因为酶切位点保护碱基是随便加的，导致酶切效率降低？急求

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1楼 2013-03-02 21:34:24

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酶切专家

金虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

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一般来说，外源片段两端设计的酶切位点的保护碱基时，对保护碱基的序列没有特定的要求，保护碱基（即添加在酶切位点5端的碱基）的个数不少于3个就足以保证扩增后的PCR产物能够顺利进行酶切。载体上，只要两个酶切位点不是相邻，一般不用担心酶切时的保护碱基问题。
但酶切时，尤其是PCR产物比较小（如小于500bp），酶切前最好对PCR产物进行DNA定量。一般PCR产物酶切时，并不需要太多，通常300-500ng就做够克隆所需，但由于PCR产物比较小（与载体相比，因而相同质量时，PCR产物的分子数比较多，因而酶切时所需要的酶量也比载体酶切时所需要的酶量多。但加的酶量过多时，又容易出现酶的星活性等问题，因而建议用double digstion disigner这个软件去计算PCR产物时所需要的酶量，http://www.bioinfomatics.cn/enzyme/showresult.php

Good luck.