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zwx26_2006

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[交流] 【求助/交流】酶切位点两端都加了保护碱基受影响吗已有5人参与

设计引物加酶切位点时，将酶切位点两端的保护碱基都加上了，这样连接时不受影响吧

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【求助/交流】SacI酶切位点的保护碱基怎么加，碱基表上的酶切效率只有10%啊已经有3人回复

1楼 2010-09-02 22:00:53

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zjzz

木虫 (正式写手)

在通往变态的坦途上

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1.如果是TA克隆不影响
2.这个，如果是酶切了之后再连，自然是没关系的，用用粘性末端连接的
3.楼主为什么会有这个疑问？

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终于熬成木虫了……

2楼2010-09-03 03:38:29

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zwx26_2006

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引用回帖:

Originally posted by zjzz at 2010-09-03 03:38:29:
1.如果是TA克隆不影响
2.这个，如果是酶切了之后再连，自然是没关系的，用用粘性末端连接的
3.楼主为什么会有这个疑问？

因为老连不上，所以就瞎找原因了

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3楼2010-09-03 09:13:14

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zjzz

木虫 (正式写手)

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引用回帖:

Originally posted by zwx26_2006 at 2010-09-03 09:13:14:

因为老连不上，所以就瞎找原因了

1.把引物单或引物管拿出来，看看上面的序列跟你定的是否一致。实验室曾经有人收到差了一个碱基的，但是人家顶多帮你重新合成一份不会赔偿你损失的时间
2.pcr片段先连TA克隆载体再切比直接切pcr线性片段好
3.外源质粒片段确定酶切完全而不是很多单酶切？
4.连接前电泳检查酶切片段回收质量是否可靠
5.连接前测外源质粒片段和连接片段的的浓度，严格按摩尔比1：3到1：6配比连接
6.感受态的效率也很重要

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终于熬成木虫了……

4楼2010-09-07 02:40:37

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