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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 重组质粒丢失一个碱基是否影响表达
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baby1_9253344

金虫 (小有名气)

[求助] 重组质粒丢失一个碱基是否影响表达

如题，欲将外源基因插入PET30a质粒的多酶切位点，表达蛋白。测序后发现在rbs前面的基因处少了个碱基A，别的地方都正常。不知道这样是否会造成错位，影响蛋白表达？
如图，红圈标出位置本应是AAA，但测序结果是AA....前面测序的图挺丑的，不过后面的峰还是挺分明的（见附件），新手，不懂怎么看测序图。求高手解答~~

测序图[ Last edited by baby1_9253344 on 2012-4-10 at 20:13 ]
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    • 2012-04-10 20:12:36, 257.25 K

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1楼 2012-04-10 19:37:23
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gywyl1977

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
telomerase: 金币+2, 谢谢你的热心应助 2012-04-10 20:56:36
baby1_9253344: 金币+2 2012-04-11 08:23:04
1）可能就是AAA，因为此处的色谱峰没有分离开，机器可能少读一个A。
2）即使少了一个A, 如果是在rbs前面，不会造成蛋白的错读，最多影响点转录效率；
3）实在不放心就重新挑个克隆测序吧，花不了几个钱的。
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3楼2012-04-10 20:43:37
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普通回帖

zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
telomerase: 金币+2, 辛苦辛苦 2012-04-10 20:56:29
baby1_9253344: 金币+2 2012-04-11 08:22:49
baby1_9253344: 金币+2, 谢谢回复~ 2012-04-11 09:10:21
测序峰图不是很好，可能是测序错误。

如果是缺掉一个碱基，会造成移码突变，只能重做。
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我有一个梦想，我梦想有一天，我们的人民可以根据自己的意愿与消费能力，居住在自己愿意居住的地方。
2楼2012-04-10 20:43:11
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baby1_9253344

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaohq1209 at 2012-04-10 20:43:11:
测序峰图不是很好，可能是测序错误。

如果是缺掉一个碱基，会造成移码突变，只能重做。

请问一个小白的问题，移码突变的话在什么位置不影响我的蛋白表达呢？换句话说，质粒基因启动的顺序是什么？
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4楼2012-04-11 08:29:11
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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by baby1_9253344 at 2012-04-11 08:29:11:
请问一个小白的问题，移码突变的话在什么位置不影响我的蛋白表达呢？换句话说，质粒基因启动的顺序是什么？

如3楼所说，在rbs之前不会造成移码，如果位于编码区，那肯定是需要重做的。但加入位于末端，也可能对蛋白的影响较小。
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我有一个梦想，我梦想有一天，我们的人民可以根据自己的意愿与消费能力，居住在自己愿意居住的地方。
5楼2012-04-11 08:34:37
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baby1_9253344

金虫 (小有名气)
"ATG上游的序列不涉及阅读框，所以在5’端HindIII位点到ATG的序列不会带来移码突变。但是在大肠杆菌中核糖体受一段富含嘌呤的SD序列引导从而识别AUG起始密码，核糖体结合位点RBS和起始密码AUG之间的距离以及碱基的组成对翻译的效率有显著影响，在设计的时候要注意。 一般建议在ATG上游加入保守序列5'-UAAGGAGGUGA-3'（其中AGGAGG是RBS保守序列），并根据预实验结果调节，如果载体本身已经带了RBS序列就可以不加。同时在ATG与RBS之间要有一定的空间序列（约小于10个碱基）， 可以采用靶基因ATG上游的序列。"这是在网上搜到的...
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6楼2012-04-11 08:59:18
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zx6291

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
baby1_9253344: 金币+2 2012-04-11 11:01:18
（1）建议重新换一家公司测序，有可能是测序的问题。
（2）如果是在ATG上面的话，可以不用再做，应该不影响表达，如果是在你的基因内部的话，应该要造成移码，建议重做。
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7楼2012-04-11 10:59:05
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baby1_9253344

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by zx6291 at 2012-04-11 10:59:05:
（1）建议重新换一家公司测序，有可能是测序的问题。
（2）如果是在ATG上面的话，可以不用再做，应该不影响表达，如果是在你的基因内部的话，应该要造成移码，建议重做。

碱基缺少是在ATG前面的，而且也在RBS前面，我基因内部没有问题。我就是搞不清基因启动的顺序，看质粒图谱，箭头方向很乱....
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8楼2012-04-11 11:01:10
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baby1_9253344

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by zx6291 at 2012-04-11 10:59:05:
（1）建议重新换一家公司测序，有可能是测序的问题。
（2）如果是在ATG上面的话，可以不用再做，应该不影响表达，如果是在你的基因内部的话，应该要造成移码，建议重做。

如图为我使用的载体PET30a，记得坛子里说粗箭头和细箭头分别对应双链里面每一个链的，那么这几个粗箭头应该都是一个方向的，细箭头是另一个方向的，但是这个图谱里f1 origin和kan的细箭头对开...看不懂了就>..
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9楼2012-04-11 11:05:25
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zx6291

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
baby1_9253344: 金币+1 2012-04-12 10:50:30
引用回帖:
8楼: Originally posted by baby1_9253344 at 2012-04-11 11:01:10:
碱基缺少是在ATG前面的，而且也在RBS前面，我基因内部没有问题。我就是搞不清基因启动的顺序，看质粒图谱，箭头方向很乱....

那就可能是两个原因，1是公司测序的问题，建议重新换一家，2是你的载体本身缺了个碱基A，我觉得1的可能性更大，而且一般测序结果前100个碱基都不太准确，因为有荧光染料的影响。只要你的插入片段没有碱基缺式就OK了。
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10楼2012-04-11 11:07:48
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