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baby1_9253344

金虫 (小有名气)

[求助] 重组质粒丢失一个碱基是否影响表达

如题,欲将外源基因插入PET30a质粒的多酶切位点,表达蛋白。测序后发现在rbs前面的基因处少了个碱基A,别的地方都正常。不知道这样是否会造成错位,影响蛋白表达?
如图,红圈标出位置本应是AAA,但测序结果是AA....前面测序的图挺丑的,不过后面的峰还是挺分明的(见附件),新手,不懂怎么看测序图。求高手解答~~

测序图[ Last edited by baby1_9253344 on 2012-4-10 at 20:13 ]
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  • 2012-04-10 20:12:36, 257.25 K

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baby1_9253344

金虫 (小有名气)

"ATG上游的序列不涉及阅读框,所以在5’端HindIII位点到ATG的序列不会带来移码突变。但是在大肠杆菌中核糖体受一段富含嘌呤的SD序列引导从而识别AUG起始密码,核糖体结合位点RBS和起始密码AUG之间的距离以及碱基的组成对翻译的效率有显著影响,在设计的时候要注意。 一般建议在ATG上游加入保守序列5'-UAAGGAGGUGA-3'(其中AGGAGG是RBS保守序列),并根据预实验结果调节,如果载体本身已经带了RBS序列就可以不加。同时在ATG与RBS之间要有一定的空间序列(约小于10个碱基), 可以采用靶基因ATG上游的序列。"这是在网上搜到的...
6楼2012-04-11 08:59:18
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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
telomerase: 金币+2, 辛苦辛苦 2012-04-10 20:56:29
baby1_9253344: 金币+2 2012-04-11 08:22:49
baby1_9253344: 金币+2, 谢谢回复~ 2012-04-11 09:10:21
测序峰图不是很好,可能是测序错误。

如果是缺掉一个碱基,会造成移码突变,只能重做。
我有一个梦想,我梦想有一天,我们的人民可以根据自己的意愿与消费能力,居住在自己愿意居住的地方。
2楼2012-04-10 20:43:11
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gywyl1977

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
telomerase: 金币+2, 谢谢你的热心应助 2012-04-10 20:56:36
baby1_9253344: 金币+2 2012-04-11 08:23:04
1)可能就是AAA,因为此处的色谱峰没有分离开,机器可能少读一个A。
2)即使少了一个A, 如果是在rbs前面,不会造成蛋白的错读,最多影响点转录效率;
3)实在不放心就重新挑个克隆测序吧,花不了几个钱的。
3楼2012-04-10 20:43:37
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baby1_9253344

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaohq1209 at 2012-04-10 20:43:11:
测序峰图不是很好,可能是测序错误。

如果是缺掉一个碱基,会造成移码突变,只能重做。

请问一个小白的问题,移码突变的话在什么位置不影响我的蛋白表达呢?换句话说,质粒基因启动的顺序是什么?
4楼2012-04-11 08:29:11
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