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baby1_9253344

金虫 (小有名气)

[求助] 重组质粒丢失一个碱基是否影响表达

如题,欲将外源基因插入PET30a质粒的多酶切位点,表达蛋白。测序后发现在rbs前面的基因处少了个碱基A,别的地方都正常。不知道这样是否会造成错位,影响蛋白表达?
如图,红圈标出位置本应是AAA,但测序结果是AA....前面测序的图挺丑的,不过后面的峰还是挺分明的(见附件),新手,不懂怎么看测序图。求高手解答~~

测序图[ Last edited by baby1_9253344 on 2012-4-10 at 20:13 ]
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gywyl1977

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
telomerase: 金币+2, 谢谢你的热心应助 2012-04-10 20:56:36
baby1_9253344: 金币+2 2012-04-11 08:23:04
1)可能就是AAA,因为此处的色谱峰没有分离开,机器可能少读一个A。
2)即使少了一个A, 如果是在rbs前面,不会造成蛋白的错读,最多影响点转录效率;
3)实在不放心就重新挑个克隆测序吧,花不了几个钱的。
3楼2012-04-10 20:43:37
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普通回帖

zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
telomerase: 金币+2, 辛苦辛苦 2012-04-10 20:56:29
baby1_9253344: 金币+2 2012-04-11 08:22:49
baby1_9253344: 金币+2, 谢谢回复~ 2012-04-11 09:10:21
测序峰图不是很好,可能是测序错误。

如果是缺掉一个碱基,会造成移码突变,只能重做。
我有一个梦想,我梦想有一天,我们的人民可以根据自己的意愿与消费能力,居住在自己愿意居住的地方。
2楼2012-04-10 20:43:11
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baby1_9253344

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaohq1209 at 2012-04-10 20:43:11:
测序峰图不是很好,可能是测序错误。

如果是缺掉一个碱基,会造成移码突变,只能重做。

请问一个小白的问题,移码突变的话在什么位置不影响我的蛋白表达呢?换句话说,质粒基因启动的顺序是什么?
4楼2012-04-11 08:29:11
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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by baby1_9253344 at 2012-04-11 08:29:11:
请问一个小白的问题,移码突变的话在什么位置不影响我的蛋白表达呢?换句话说,质粒基因启动的顺序是什么?

如3楼所说,在rbs之前不会造成移码,如果位于编码区,那肯定是需要重做的。但加入位于末端,也可能对蛋白的影响较小。
我有一个梦想,我梦想有一天,我们的人民可以根据自己的意愿与消费能力,居住在自己愿意居住的地方。
5楼2012-04-11 08:34:37
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baby1_9253344

金虫 (小有名气)

"ATG上游的序列不涉及阅读框,所以在5’端HindIII位点到ATG的序列不会带来移码突变。但是在大肠杆菌中核糖体受一段富含嘌呤的SD序列引导从而识别AUG起始密码,核糖体结合位点RBS和起始密码AUG之间的距离以及碱基的组成对翻译的效率有显著影响,在设计的时候要注意。 一般建议在ATG上游加入保守序列5'-UAAGGAGGUGA-3'(其中AGGAGG是RBS保守序列),并根据预实验结果调节,如果载体本身已经带了RBS序列就可以不加。同时在ATG与RBS之间要有一定的空间序列(约小于10个碱基), 可以采用靶基因ATG上游的序列。"这是在网上搜到的...
6楼2012-04-11 08:59:18
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zx6291

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
baby1_9253344: 金币+2 2012-04-11 11:01:18
(1)建议重新换一家公司测序,有可能是测序的问题。
(2)如果是在ATG上面的话,可以不用再做,应该不影响表达,如果是在你的基因内部的话,应该要造成移码,建议重做。
7楼2012-04-11 10:59:05
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baby1_9253344

金虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by zx6291 at 2012-04-11 10:59:05:
(1)建议重新换一家公司测序,有可能是测序的问题。
(2)如果是在ATG上面的话,可以不用再做,应该不影响表达,如果是在你的基因内部的话,应该要造成移码,建议重做。

碱基缺少是在ATG前面的,而且也在RBS前面,我基因内部没有问题。我就是搞不清基因启动的顺序,看质粒图谱,箭头方向很乱....
8楼2012-04-11 11:01:10
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baby1_9253344

金虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by zx6291 at 2012-04-11 10:59:05:
(1)建议重新换一家公司测序,有可能是测序的问题。
(2)如果是在ATG上面的话,可以不用再做,应该不影响表达,如果是在你的基因内部的话,应该要造成移码,建议重做。

如图为我使用的载体PET30a,记得坛子里说粗箭头和细箭头分别对应双链里面每一个链的,那么这几个粗箭头应该都是一个方向的,细箭头是另一个方向的,但是这个图谱里f1 origin和kan的细箭头对开...看不懂了就>..


9楼2012-04-11 11:05:25
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zx6291

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


baby1_9253344: 金币+1 2012-04-12 10:50:30
引用回帖:
8楼: Originally posted by baby1_9253344 at 2012-04-11 11:01:10:
碱基缺少是在ATG前面的,而且也在RBS前面,我基因内部没有问题。我就是搞不清基因启动的顺序,看质粒图谱,箭头方向很乱....

那就可能是两个原因,1是公司测序的问题,建议重新换一家,2是你的载体本身缺了个碱基A,我觉得1的可能性更大,而且一般测序结果前100个碱基都不太准确,因为有荧光染料的影响。只要你的插入片段没有碱基缺式就OK了。
10楼2012-04-11 11:07:48
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