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zwx26_2006

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】酶切位点两端都加了保护碱基受影响吗 已有5人参与

设计引物加酶切位点时,将酶切位点两端的保护碱基都加上了,这样连接时不受影响吧
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silicare

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小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
加保护碱基就是为了不连接T载体直接酶切的!
5楼2010-09-07 12:16:48
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zjzz

木虫 (正式写手)

在通往变态的坦途上


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
1.如果是TA克隆不影响
2.这个,如果是酶切了之后再连,自然是没关系的,用用粘性末端连接的
3.楼主为什么会有这个疑问?
终于熬成木虫了……
2楼2010-09-03 03:38:29
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zwx26_2006

银虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by zjzz at 2010-09-03 03:38:29:
1.如果是TA克隆不影响
2.这个,如果是酶切了之后再连,自然是没关系的,用用粘性末端连接的
3.楼主为什么会有这个疑问?

因为老连不上,所以就瞎找原因了
3楼2010-09-03 09:13:14
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zjzz

木虫 (正式写手)

在通往变态的坦途上


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by zwx26_2006 at 2010-09-03 09:13:14:



因为老连不上,所以就瞎找原因了

1.把引物单或引物管拿出来,看看上面的序列跟你定的是否一致。实验室曾经有人收到差了一个碱基的,但是人家顶多帮你重新合成一份不会赔偿你损失的时间
2.pcr片段先连TA克隆载体再切比直接切pcr线性片段好
3.外源质粒片段确定酶切完全而不是很多单酶切?
4.连接前电泳检查酶切片段回收质量是否可靠
5.连接前测外源质粒片段和连接片段的的浓度,严格按摩尔比1:3到1:6配比连接
6.感受态的效率也很重要
终于熬成木虫了……
4楼2010-09-07 02:40:37
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