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jerrity

木虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】pstI的保护碱基的加法

在设计引物时需要加上pstI的酶切位点，但是我看了下pstI的保护碱基怎么加那么多？ 还有neb酶 在片段两端的活性高吗  我想直接用双酶切pcr产物的两端，直接连接载体 可以吗？成功率高吗
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1楼 2010-11-10 20:34:42
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j2

木虫 (正式写手)
jerrity(金币+1): 2010-11-11 14:44:40
加了保护碱基应该还好吧，只要酶切完全连接是没问题的
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2楼2010-11-11 13:18:50
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wuyexu1205

金虫 (小有名气)
jerrity(金币+1): 2010-11-11 14:44:53
jerrity(金币+2): 2011-04-25 18:48:11
引用回帖:
Originally posted by jerrity at 2010-11-10 20:34:42:
在设计引物时需要加上pstI的酶切位点，但是我看了下pstI的保护碱基怎么加那么多？ 还有neb酶 在片段两端的活性高吗  我想直接用双酶切pcr产物的两端，直接连接载体 可以吗？成功率高吗

可以的，以前我经常做这些实验。一般酶切保护碱基加两个就可以的，具体的你可以看下TAKARA的目录，那上面有对应的内切酶加保护碱基后正确切割的效率。
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3楼2010-11-11 14:05:16
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yabxxh

木虫 (正式写手)
jerrity(金币+2): 2010-11-11 14:45:41
jerrity(金币+2): 2011-04-25 18:48:20
保护碱基一般可以参照neb的那个表格，一般2-3个就可以了，再结合自己的引物的TM值适当调整所加碱基，使两条引物的Tm尽量靠近。
现在的酶都有高效快速的了，前端加两个就可以了
最好能做一个亚克隆吧，这样能保证试验进度，也不存在酶切不完全的问题。当然，如果你的PCR产物很容易得到，也可以直接双酶切了连接骨架载体
祝顺利
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4楼2010-11-11 14:43:01
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jerrity

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by yabxxh at 2010-11-11 14:43:01:
保护碱基一般可以参照neb的那个表格，一般2-3个就可以了，再结合自己的引物的TM值适当调整所加碱基，使两条引物的Tm尽量靠近。
现在的酶都有高效快速的了，前端加两个就可以了
最好能做一个亚克隆吧，这样能保证 ...

neb上 pstI的保护碱基 加的很多啊 最多有10多个，例如
AAAA CTGCAG CCAATGCATTGGAA
我想问它后面的碱基算不算？
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5楼2010-11-11 14:49:14
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