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jerrity

木虫 (小有名气)


[交流] 【求助/交流】pstI的保护碱基的加法

在设计引物时需要加上pstI的酶切位点,但是我看了下pstI的保护碱基怎么加那么多? 还有neb酶 在片段两端的活性高吗  我想直接用双酶切pcr产物的两端,直接连接载体 可以吗?成功率高吗
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j2

木虫 (正式写手)


jerrity(金币+1): 2010-11-11 14:44:40
加了保护碱基应该还好吧,只要酶切完全连接是没问题的
2楼2010-11-11 13:18:50
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wuyexu1205

金虫 (小有名气)


jerrity(金币+1): 2010-11-11 14:44:53
jerrity(金币+2): 2011-04-25 18:48:11
引用回帖:
Originally posted by jerrity at 2010-11-10 20:34:42:
在设计引物时需要加上pstI的酶切位点,但是我看了下pstI的保护碱基怎么加那么多? 还有neb酶 在片段两端的活性高吗  我想直接用双酶切pcr产物的两端,直接连接载体 可以吗?成功率高吗

可以的,以前我经常做这些实验。一般酶切保护碱基加两个就可以的,具体的你可以看下TAKARA的目录,那上面有对应的内切酶加保护碱基后正确切割的效率。
3楼2010-11-11 14:05:16
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yabxxh

木虫 (正式写手)


jerrity(金币+2): 2010-11-11 14:45:41
jerrity(金币+2): 2011-04-25 18:48:20
保护碱基一般可以参照neb的那个表格,一般2-3个就可以了,再结合自己的引物的TM值适当调整所加碱基,使两条引物的Tm尽量靠近。
现在的酶都有高效快速的了,前端加两个就可以了
最好能做一个亚克隆吧,这样能保证试验进度,也不存在酶切不完全的问题。当然,如果你的PCR产物很容易得到,也可以直接双酶切了连接骨架载体
祝顺利
4楼2010-11-11 14:43:01
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jerrity

木虫 (小有名气)


引用回帖:
Originally posted by yabxxh at 2010-11-11 14:43:01:
保护碱基一般可以参照neb的那个表格,一般2-3个就可以了,再结合自己的引物的TM值适当调整所加碱基,使两条引物的Tm尽量靠近。
现在的酶都有高效快速的了,前端加两个就可以了
最好能做一个亚克隆吧,这样能保证 ...

neb上 pstI的保护碱基 加的很多啊 最多有10多个,例如
AAAA CTGCAG CCAATGCATTGGAA
我想问它后面的碱基算不算?
5楼2010-11-11 14:49:14
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