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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】限制性内切酶保护碱基
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xwsooo

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】限制性内切酶保护碱基

最近要准备做酶切，我不太懂内切酶保护碱基什么意思？引物已经拿给公司合成去了，我并没有考虑到设计什么保护碱基，这有关系么？
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1楼2011-04-10 22:17:22
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
xwsooo(金币+1):谢谢参与
dhd997(金币+6, EPI+1): good 2011-04-11 12:40:34
引用回帖:
Originally posted by xwsooo at 2011-04-10 22:17:22:
最近要准备做酶切，我不太懂内切酶保护碱基什么意思？引物已经拿给公司合成去了，我并没有考虑到设计什么保护碱基，这有关系么？

限制性内切酶识别特定的DNA序列，除此之外，酶蛋白还要占据识别位点两边的若干个碱基，这些碱基对内切酶稳定的结合到DNA双链并发挥切割DNA作用是有很大影响的，被称为保护碱基。

其实保护碱基没有必要太纠结，在引物的酶切位点外面再加3个以上的碱基就可以了。这里说得很详细，还五颜六色滴，我就不粘过来啦：
http://www.bioask.cn/html/86.html

特别赞成这句：添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。
以前NEB弄了个保护碱基的表，还放在他们的产品目录里。不过现在的产品目录已经没有这个表了，说明NEB也意识到没必要纠结保护碱基的种类了。
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2楼2011-04-10 22:36:28
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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)
★
xwsooo(金币+1):谢谢参与
引用回帖:
Originally posted by 西瓜 at 2011-04-10 22:36:28:
限制性内切酶识别特定的DNA序列，除此之外，酶蛋白还要占据识别位点两边的若干个碱基，这些碱基对内切酶稳定的结合到DNA双链并发挥切割DNA作用是有很大影响的，被称为保护碱基。

其实保护碱基没有必要太纠结 ...

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3楼2011-04-10 23:45:09
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roomofxw

木虫 (正式写手)
★
xwsooo(金币+1):谢谢参与
连到T载体上再切
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4楼2011-04-11 09:13:15
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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)
★
xwsooo(金币+1):谢谢参与
引用回帖:
Originally posted by roomofxw at 2011-04-11 09:13:15:
连到T载体上再切

好办法
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6楼2011-04-11 11:11:28
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天使托

专家顾问 (职业作家)
★ ★ ★ ★ ★ ★
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dhd997(金币+5): good 2011-04-11 12:40:48
保护碱基的目的就是保护引物的，其是也并不一定要添加什么样的保护碱基，只要保证两条引物的GC含量 TM值神马的基本一致就可以，但只有一个目的：就是把目的片段很亮很好的扩增出来，就这个目的！
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7楼2011-04-11 11:29:57
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+3): good 2011-04-11 12:40:58
设计引物的时候在5‘端添加4-5个碱基就可以，只要对GC含量没什么大影响，不产生二级结构就可以了
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8楼2011-04-11 12:20:52
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xwsooo

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 西瓜 at 2011-04-10 22:36:28:
限制性内切酶识别特定的DNA序列，除此之外，酶蛋白还要占据识别位点两边的若干个碱基，这些碱基对内切酶稳定的结合到DNA双链并发挥切割DNA作用是有很大影响的，被称为保护碱基。

其实保护碱基没有必要太纠结 ...

灰常感谢您提供的具体信息。我学习了下，是不是如果酶切位点并不是在5‘一端，而是在扩增片段的中间部分就不用考虑保护碱基，是吗？
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9楼2011-04-11 13:33:02
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by xwsooo at 2011-04-11 13:33:02:
灰常感谢您提供的具体信息。我学习了下，是不是如果酶切位点并不是在5‘一端，而是在扩增片段的中间部分就不用考虑保护碱基，是吗？

是这样的，呵呵
酶切位点在中间，两边已经有了大段的序列，那就确实不用考虑保护碱基了。

如果是在引物上引入酶切位点，那保护碱基可以用来调节GC含量、Tm值。
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10楼2011-04-11 13:52:48
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xwsooo

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 西瓜 at 2011-04-11 13:52:48:
是这样的，呵呵
酶切位点在中间，两边已经有了大段的序列，那就确实不用考虑保护碱基了。

如果是在引物上引入酶切位点，那保护碱基可以用来调节GC含量、Tm值。

哦，酱紫啊，多谢
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11楼2011-04-11 14:57:54
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td0605

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
连接T载体，转化、摇菌、提质粒后再切！
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12楼2011-04-11 15:00:21
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龙31月彬

新虫 (初入文坛)

很好
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13楼2011-11-07 12:26:11
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ideal9268

铜虫 (小有名气)
★ ★
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西瓜(金币+1): 鼓励应助 2011-11-07 18:29:01
保护性碱基是保护酶切位点的，简单来说就是在酶切时给酶提供一个“着陆点”。而且不同的酶都有最合适自己的保护性碱基，所以，如果你还没开始用这个引物，建议你重新设计引物，加上保护性碱基。否则在酶切的时候可能遇到麻烦。
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14楼2011-11-07 14:47:20
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honey倩

铜虫 (小有名气)
★
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引用回帖:
568354楼: Originally posted by 天使托 at 2011-04-11 11:29:57:
保护碱基的目的就是保护引物的，其是也并不一定要添加什么样的保护碱基，只要保证两条引物的GC含量 TM值神马的基本一致就可以，但只有一个目的：就是把目的片段很亮很好的扩增出来，就这个目的！

您好，我现在PCR设计的引物，酶切位点之前按照NEB那个表加上保护碱基之后就会出现二级结构，我随便加上几个之后就会避免耳机结构的出现，但是没有用其他的软件进行分析，这种情况的话能保证合成出来吗？
麻烦给分析一下吧…谢谢啦
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16楼2012-03-26 17:25:26
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honey倩

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
575244楼: Originally posted by 西瓜 at 2011-04-11 13:52:48:
是这样的，呵呵
酶切位点在中间，两边已经有了大段的序列，那就确实不用考虑保护碱基了。

如果是在引物上引入酶切位点，那保护碱基可以用来调节GC含量、Tm值。

我刚刚设计的引物，加的酶为Sac 1，那个NEB的表上给出的保护碱基是一个C，我觉着GC含量有点低了Tm值有点高，就又在前边加了一个G，不知道这样会不会影响之后的PCR反应
我觉着我老是问你问题呢，谢谢你的指导，嘿嘿，真的很感谢
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17楼2012-03-26 19:56:04
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
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1254725楼: Originally posted by honey倩 at 2012-03-26 19:56:04:
我刚刚设计的引物，加的酶为Sac 1，那个NEB的表上给出的保护碱基是一个C，我觉着GC含量有点低了Tm值有点高，就又在前边加了一个G，不知道这样会不会影响之后的PCR反应
我觉着我老是问你问题呢，谢谢你的 ...

保护碱基一般加4个以上就可以了。我有时候只用3个，也没有问题。
NEB那个表不用在意，对于保护碱基，数目比碱基类型影响更大，你可以灵活改变碱基的数量和类型来调节Ct值、Tm值或者避免引物二聚体等。不过，如果那个表给出的保护碱基需要很多个，那你就多加一些就行了。
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18楼2012-03-26 20:55:33
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honey倩

铜虫 (小有名气)
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1254734楼: Originally posted by 西瓜 at 2012-03-26 20:55:33:
保护碱基一般加4个以上就可以了。我有时候只用3个，也没有问题。
NEB那个表不用在意，对于保护碱基，数目比碱基类型影响更大，你可以灵活改变碱基的数量和类型来调节Ct值、Tm值或者避免引物二聚体等。不过，如果 ...

哦~他给出的是一个C，我又加了一个G，我估计应该没事，我看前边师姐做的就是加了两个呢，呵呵，谢谢啦
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19楼2012-03-27 09:15:31
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
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引用回帖:
1254791楼: Originally posted by honey倩 at 2012-03-27 09:15:31:
哦~他给出的是一个C，我又加了一个G，我估计应该没事，我看前边师姐做的就是加了两个呢，呵呵，谢谢啦

不客气啊，呵呵~那应该Ok了
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20楼2012-03-27 11:23:26
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天使托

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1254697楼: Originally posted by honey倩 at 2012-03-26 17:25:26:
您好，我现在PCR设计的引物，酶切位点之前按照NEB那个表加上保护碱基之后就会出现二级结构，我随便加上几个之后就会避免耳机结构的出现，但是没有用其他的软件进行分析，这种情况的话能保证合成出来吗？
麻烦给 ...

这个关系不大，没事的，尽管去合成吧。。。
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21楼2012-03-27 21:46:37
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sfb10205楼
2011-04-11 09:13   回复  
xwsooo(金币+1):谢谢参与
86531000715楼
2012-02-19 17:14   回复  
顶！！！
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