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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】限制性内切酶保护碱基
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xwsooo

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】限制性内切酶保护碱基

最近要准备做酶切，我不太懂内切酶保护碱基什么意思？引物已经拿给公司合成去了，我并没有考虑到设计什么保护碱基，这有关系么？
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1楼2011-04-10 22:17:22
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
1254725楼: Originally posted by honey倩 at 2012-03-26 19:56:04:
我刚刚设计的引物，加的酶为Sac 1，那个NEB的表上给出的保护碱基是一个C，我觉着GC含量有点低了Tm值有点高，就又在前边加了一个G，不知道这样会不会影响之后的PCR反应
我觉着我老是问你问题呢，谢谢你的 ...

保护碱基一般加4个以上就可以了。我有时候只用3个，也没有问题。
NEB那个表不用在意，对于保护碱基，数目比碱基类型影响更大，你可以灵活改变碱基的数量和类型来调节Ct值、Tm值或者避免引物二聚体等。不过，如果那个表给出的保护碱基需要很多个，那你就多加一些就行了。
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18楼2012-03-26 20:55:33
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
xwsooo(金币+1):谢谢参与
dhd997(金币+6, EPI+1): good 2011-04-11 12:40:34
引用回帖:
Originally posted by xwsooo at 2011-04-10 22:17:22:
最近要准备做酶切，我不太懂内切酶保护碱基什么意思？引物已经拿给公司合成去了，我并没有考虑到设计什么保护碱基，这有关系么？

限制性内切酶识别特定的DNA序列，除此之外，酶蛋白还要占据识别位点两边的若干个碱基，这些碱基对内切酶稳定的结合到DNA双链并发挥切割DNA作用是有很大影响的，被称为保护碱基。

其实保护碱基没有必要太纠结，在引物的酶切位点外面再加3个以上的碱基就可以了。这里说得很详细，还五颜六色滴，我就不粘过来啦：
http://www.bioask.cn/html/86.html

特别赞成这句：添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。
以前NEB弄了个保护碱基的表，还放在他们的产品目录里。不过现在的产品目录已经没有这个表了，说明NEB也意识到没必要纠结保护碱基的种类了。
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2楼2011-04-10 22:36:28
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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)
★
xwsooo(金币+1):谢谢参与
引用回帖:
Originally posted by 西瓜 at 2011-04-10 22:36:28:
限制性内切酶识别特定的DNA序列，除此之外，酶蛋白还要占据识别位点两边的若干个碱基，这些碱基对内切酶稳定的结合到DNA双链并发挥切割DNA作用是有很大影响的，被称为保护碱基。

其实保护碱基没有必要太纠结 ...

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3楼2011-04-10 23:45:09
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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)
★
xwsooo(金币+1):谢谢参与
引用回帖:
Originally posted by roomofxw at 2011-04-11 09:13:15:
连到T载体上再切

好办法
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6楼2011-04-11 11:11:28
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