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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】酶切位点两端都加了保护碱基受影响吗
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zwx26_2006

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】酶切位点两端都加了保护碱基受影响吗 已有5人参与

设计引物加酶切位点时，将酶切位点两端的保护碱基都加上了，这样连接时不受影响吧
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1楼 2010-09-02 22:00:53
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圣主魂

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
5楼: Originally posted by silicare at 2010-09-07 12:16:48
加保护碱基就是为了不连接T载体直接酶切的！

那直接酶切 再回收后 就连上表达载体上了 可酶切的条带比目的条带短 这是怎么回事啊
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9楼2014-10-06 13:48:11
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zjzz

木虫 (正式写手)

在通往变态的坦途上
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1.如果是TA克隆不影响
2.这个，如果是酶切了之后再连，自然是没关系的，用用粘性末端连接的
3.楼主为什么会有这个疑问？
赞一下(1人) 回复此楼
终于熬成木虫了……
2楼2010-09-03 03:38:29
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zwx26_2006

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by zjzz at 2010-09-03 03:38:29:
1.如果是TA克隆不影响
2.这个，如果是酶切了之后再连，自然是没关系的，用用粘性末端连接的
3.楼主为什么会有这个疑问？

因为老连不上，所以就瞎找原因了
赞一下 回复此楼
3楼2010-09-03 09:13:14
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zjzz

木虫 (正式写手)

在通往变态的坦途上
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by zwx26_2006 at 2010-09-03 09:13:14:



因为老连不上，所以就瞎找原因了

1.把引物单或引物管拿出来，看看上面的序列跟你定的是否一致。实验室曾经有人收到差了一个碱基的，但是人家顶多帮你重新合成一份不会赔偿你损失的时间
2.pcr片段先连TA克隆载体再切比直接切pcr线性片段好
3.外源质粒片段确定酶切完全而不是很多单酶切？
4.连接前电泳检查酶切片段回收质量是否可靠
5.连接前测外源质粒片段和连接片段的的浓度，严格按摩尔比1：3到1：6配比连接
6.感受态的效率也很重要
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终于熬成木虫了……
4楼2010-09-07 02:40:37
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