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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助啊！转质粒出现问题了！
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萝卜丝儿

木虫 (小有名气)

[求助] 求助啊！转质粒出现问题了！

从公司买来了一段基因（3.7kb），那段基因是连在公司提供的质粒（2.7KB+3.7kb）上的，然后拿回来后就转入E.coli，然后就是扩增，提质粒，酶切跑电泳，切胶回收（3.7kb），再把那个基因连到我们实验室自己构建的载体（7.3kb）上，然后再做E.coli转化，但是很妖的事情发生了！！涂版以后，挑取长出来的单克隆，扩增，提质粒，酶切鉴定，得出的结果是3.7kb+2.7kb。。。做了好多好多遍都是这个结果，然后还用了菌落pcr鉴定那个质粒上的基因，结果是正确的。。这到底是怎么回事啊？求各位帮忙啊！！

师兄一开始认为我实验技能不过关，然后自己上来做，也是这个情况，其他博后过来指导，结果也是这个，这到底是怎么回事啊？去磷酸化也做过了，但还是这个情况。。。
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好好学习，天天向上！
1楼 2011-05-29 17:23:58
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silicare

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【答案】应助回帖

萝卜丝儿(金币+2): 2011-06-05 15:11:25
引用回帖:
Originally posted by 萝卜丝儿 at 2011-05-30 05:10:23:
操作方面绝对不存在问题，为了让这两个条带跑开，特地用长胶跑的，分的很开，但是第二个载体连另外设计的4个基因，情况都很好。。。就是唯独这一个情况很诡异。。。

超螺旋的速度可不是按规矩来的

你的没有切开的部分质粒是可以存在于你的大片段里的

你的对照做了吗

有没有直接把你回收的3.7kb片段做转化？有没有把你的3.7kb片段做一个自连，然后做转化？如果这个没做，说明你的实验本身设计就不够完善

从你的描述看，首要的怀疑点就是没完全切开，导致后续的失败

其次，还有注意是不是你的菌在转化似乎操作上污染，这样问题也需要做一个转化水的对照

你的问题是实验室做基因克隆常见的问题，一点都不诡异，见多了就自然不怪了，


顺便批评一下你的一句话，确切的说是你的态度：" 操作方面绝对不存在问题" 新手以后切忌说这句话！！

科研水深
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8楼2011-05-30 11:59:22
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普通回帖

gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

把2.7kb的测序吧。。。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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2楼2011-05-29 19:47:03
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lw582482481

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

萝卜丝儿(金币+1): 2011-06-05 15:11:06
你这个只能说明一个问题，实验污染了。
1.  首先是你构建的第一个质粒i，在酶切胶回收片段不纯，混有没有切干净的质粒或者载体片段，这都有可能。因为片段差距不是很大
2. 你们的第二个载体很大本身连接不是很好长克隆。

改进的方法就是你把第一个载体换一下，换成一个和你的目的片段大小差距较大的载体。
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30而立
3楼2011-05-29 20:54:38
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萝卜丝儿

木虫 (小有名气)
silicare: why 2011-05-30 11:53:09
引用回帖:
Originally posted by gongeleven at 2011-05-29 12:47:03:
把2.7kb的测序吧。。。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]

我很早就跟师兄说了，但是貌似他不肯去测序。。。
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好好学习，天天向上！
4楼2011-05-30 04:06:29
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萝卜丝儿

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by lw582482481 at 2011-05-29 13:54:38:
你这个只能说明一个问题，实验污染了。
1.  首先是你构建的第一个质粒i，在酶切胶回收片段不纯，混有没有切干净的质粒或者载体片段，这都有可能。因为片段差距不是很大
2. 你们的第二个载体很大本身连接不是很好 ...

操作方面绝对不存在问题，为了让这两个条带跑开，特地用长胶跑的，分的很开，但是第二个载体连另外设计的4个基因，情况都很好。。。就是唯独这一个情况很诡异。。。
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好好学习，天天向上！
5楼2011-05-30 05:10:23
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yguang

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

萝卜丝儿(金币+1): 2011-06-05 15:11:16
以买来的片段为模板设计引物做PCR，连T载体，从T上切下来连你的载体！
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6楼2011-05-30 07:33:27
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iaminxanadu

木虫 (正式写手)
很可能就是污染
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7楼2011-05-30 08:28:31
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285459331

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

萝卜丝儿(金币+1): 2011-06-05 15:11:35
引用回帖:
Originally posted by 萝卜丝儿 at 2011-05-29 17:23:58:
从公司买来了一段基因（3.7kb），那段基因是连在公司提供的质粒（2.7KB+3.7kb）上的，然后拿回来后就转入E.coli，然后就是扩增，提质粒，酶切跑电泳，切胶回收（3.7kb），再把那个基因连到我们实验室自己构建的载 ...

有博士有博后的实验室应该不差啊，这个肯定得测序的。
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生命不止，奋斗不息
9楼2011-05-30 14:50:45
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hanjun80

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

萝卜丝儿(金币+1): 2011-06-05 15:11:42
是质粒的模板污染。

你用PCR从质粒上扩增目的片段以后，先用DpnI把质粒模板消化掉，然后再切胶回收，酶切连接

不要直接从质粒上切下来……
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我笃信:人定胜天！
10楼2011-06-01 17:43:26
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