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萝卜丝儿

木虫 (小有名气)

[求助] 求助啊!转质粒出现问题了!

从公司买来了一段基因(3.7kb),那段基因是连在公司提供的质粒(2.7KB+3.7kb)上的,然后拿回来后就转入E.coli,然后就是扩增,提质粒,酶切跑电泳,切胶回收(3.7kb),再把那个基因连到我们实验室自己构建的载体(7.3kb)上,然后再做E.coli转化,但是很妖的事情发生了!!涂版以后,挑取长出来的单克隆,扩增,提质粒,酶切鉴定,得出的结果是3.7kb+2.7kb。。。做了好多好多遍都是这个结果,然后还用了菌落pcr鉴定那个质粒上的基因,结果是正确的。。这到底是怎么回事啊?求各位帮忙啊!!

师兄一开始认为我实验技能不过关,然后自己上来做,也是这个情况,其他博后过来指导,结果也是这个,这到底是怎么回事啊?去磷酸化也做过了,但还是这个情况。。。
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好好学习,天天向上!
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hanjun80

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

萝卜丝儿(金币+1): 2011-06-05 15:11:42
是质粒的模板污染。

你用PCR从质粒上扩增目的片段以后,先用DpnI把质粒模板消化掉,然后再切胶回收,酶切连接

不要直接从质粒上切下来……
我笃信:人定胜天!
10楼2011-06-01 17:43:26
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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

把2.7kb的测序吧。。。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
2楼2011-05-29 19:47:03
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lw582482481

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

萝卜丝儿(金币+1): 2011-06-05 15:11:06
你这个只能说明一个问题,实验污染了。
1.  首先是你构建的第一个质粒i,在酶切胶回收片段不纯,混有没有切干净的质粒或者载体片段,这都有可能。因为片段差距不是很大
2. 你们的第二个载体很大本身连接不是很好长克隆。

改进的方法就是你把第一个载体换一下,换成一个和你的目的片段大小差距较大的载体。
30而立
3楼2011-05-29 20:54:38
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萝卜丝儿

木虫 (小有名气)

silicare: why 2011-05-30 11:53:09
引用回帖:
Originally posted by gongeleven at 2011-05-29 12:47:03:
把2.7kb的测序吧。。。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]

我很早就跟师兄说了,但是貌似他不肯去测序。。。
好好学习,天天向上!
4楼2011-05-30 04:06:29
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