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萝卜丝儿

木虫 (小有名气)

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[求助] 求助啊！转质粒出现问题了！

从公司买来了一段基因（3.7kb），那段基因是连在公司提供的质粒（2.7KB+3.7kb）上的，然后拿回来后就转入E.coli，然后就是扩增，提质粒，酶切跑电泳，切胶回收（3.7kb），再把那个基因连到我们实验室自己构建的载体（7.3kb）上，然后再做E.coli转化，但是很妖的事情发生了！！涂版以后，挑取长出来的单克隆，扩增，提质粒，酶切鉴定，得出的结果是3.7kb+2.7kb。。。做了好多好多遍都是这个结果，然后还用了菌落pcr鉴定那个质粒上的基因，结果是正确的。。这到底是怎么回事啊？

求各位帮忙啊！！

师兄一开始认为我实验技能不过关，然后自己上来做，也是这个情况，其他博后过来指导，结果也是这个，这到底是怎么回事啊？去磷酸化也做过了，但还是这个情况。。。

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好好学习，天天向上！

1楼2011-05-29 17:23:58

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silicare

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【答案】应助回帖

萝卜丝儿(金币+2): 2011-06-05 15:11:25

引用回帖:

Originally posted by 萝卜丝儿 at 2011-05-30 05:10:23:
操作方面绝对不存在问题，为了让这两个条带跑开，特地用长胶跑的，分的很开，但是第二个载体连另外设计的4个基因，情况都很好。。。就是唯独这一个情况很诡异。。。

超螺旋的速度可不是按规矩来的

你的没有切开的部分质粒是可以存在于你的大片段里的

你的对照做了吗

有没有直接把你回收的3.7kb片段做转化？有没有把你的3.7kb片段做一个自连，然后做转化？如果这个没做，说明你的实验本身设计就不够完善

从你的描述看，首要的怀疑点就是没完全切开，导致后续的失败

其次，还有注意是不是你的菌在转化似乎操作上污染，这样问题也需要做一个转化水的对照

你的问题是实验室做基因克隆常见的问题，一点都不诡异，见多了就自然不怪了，

顺便批评一下你的一句话，确切的说是你的态度：" 操作方面绝对不存在问题" 新手以后切忌说这句话！！

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