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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 重组质粒构建 连接转化效率低 求帮助啊
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huguangdong

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
明天到电脑上好好给你说说，看了很多人回复都没说到要害

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11楼2014-04-05 00:02:31
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windleakey

金虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by huguangdong at 2014-04-05 00:02:31
明天到电脑上好好给你说说，看了很多人回复都没说到要害

好啊，谢谢，真心求指点啊，真是找不出问题，再做不出就要找人帮着做了
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12楼2014-04-05 00:19:05
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huguangdong

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
windleakey(西门吹雪170代发): 金币+7, 鼓励热心回帖交流 2014-04-06 16:28:21
解答如下：
1 首先检查引物两端酶切位点是否设计正确，有没有失误，尽管从电泳图来看没什么问题，但这是解决问题的第一步。
2 其次，酶切虽然切开了，但是由于你酶切时间过短，你用的那个公司的内切酶效率如何又不知，以我个人经验NEB的内切酶双酶切在4小时以上，TAKARA和MBI的6小时以上，从你的电泳图片来看目的片段切开没问题，但是载体是否之切开了一个酶无法鉴定，所以你要延长酶切事件，尽管你这个实验这方面的原因很小，但是还是要排除。
3 用Solution I 做连接没有问题，本人亲自测试，效率高过T4连接酶，且适合各种连接方式，不仅仅是TA克隆，有问题的是你的连接条件，最佳连接条件是 4 ℃ 24 h，可保证最大限度的连接反应。这个条件是用于各种连接方式，不仅仅是TA，此外体系最好是10ul，目的片段要多，其和载体浓度比在5:1以上，通常我做起来目的片段的浓度如果是100ng/UL，载体40ng/ul。那么就是目的片段4ul，载体1ul，Solution I 5ul。
4 另外，PET28A作为一种低拷贝质粒，转化过程中的感受态细胞要求较高，你是商品化的应该没问题，还有抗性一定要确认好，板子没问题，一些列都排除如果还做不出来，那我也没法子。
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13楼2014-04-05 09:50:50
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huguangdong

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

另外，你说关于胶回收洗脱的问题，按照试剂盒操作都没问题，纯化后检测OD值，看是否有有机物、蛋白或RNA污染，这些都是影响下一步实验的因素。
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windleakey
14楼2014-04-05 09:53:00
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soholj

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
浓度太高了，稀释下，再按载体和片段的比例连接，应该就行，其实只要一点点就可以

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15楼2014-04-05 10:21:05
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windleakey

金虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
14楼: Originally posted by huguangdong at 2014-04-05 09:53:00
另外，你说关于胶回收洗脱的问题，按照试剂盒操作都没问题，纯化后检测OD值，看是否有有机物、蛋白或RNA污染，这些都是影响下一步实验的因素。

感谢解答，引物没问题；酶切我切过pet28a空质粒，和pet28a带着目的基因的(酶切位点也是那两个)，切后电泳在一水平，应该可以证明切的效果可以吧，除非出现把粘性末端切除的情况。。。关于连接我也尝试了好多种，都不行；您说的最后一种，是我最担心的，就是污染的问题，我测了OD，发现盐离子浓度很高，所以马上要做下乙醇沉淀试一下；最近问了一个老师，他说连接不上多是因为酶切不好，Takara的这俩酶（Bamh1、Ecor1）一起切应该没啥问题吧?
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16楼2014-04-05 20:11:32
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windleakey

金虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by soholj at 2014-04-05 10:21:05
浓度太高了，稀释下，再按载体和片段的比例连接，应该就行，其实只要一点点就可以

感谢回答，片段浓度太高会影响连接吗？
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17楼2014-04-05 20:12:25
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huguangdong

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
16楼: Originally posted by windleakey at 2014-04-05 20:11:32
感谢解答，引物没问题；酶切我切过pet28a空质粒，和pet28a带着目的基因的(酶切位点也是那两个)，切后电泳在一水平，应该可以证明切的效果可以吧，除非出现把粘性末端切除的情况。。。关于连接我也尝试了好多种，都 ...

TAKARA的内切酶品质没什么问题，那你就要加长酶切时间。
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18楼2014-04-05 20:38:44
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fghjkyt

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
windleakey(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-04-06 16:28:47
我们对经典基因克隆方法进行了小改进， 效果很明显， 特别是对平末端连接，单酶切产物连接，和某些双酶切连接有用：
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24613256
由于时间和实验条件有限，水平也有限， 做得不是很好
   但是很简单方便，对你的难题或许有帮助，值得一试。
如果有帮助， 发表论文的时候，一定别忘了引用哦， 谢谢！！！！
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19楼2014-04-06 09:24:47
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soholj

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
17楼: Originally posted by windleakey at 2014-04-05 20:12:25
感谢回答，片段浓度太高会影响连接吗？...

会的，之前我们实验室遇到过，条带很亮，连接两个月都连接不上，后来测浓度，稀释后一下就连接上了~,你试一下
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20楼2014-04-08 11:02:24
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