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huguangdong

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
明天到电脑上好好给你说说,看了很多人回复都没说到要害

[ 发自小木虫客户端 ]
11楼2014-04-05 00:02:31
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windleakey

金虫 (小有名气)

引用回帖:
11楼: Originally posted by huguangdong at 2014-04-05 00:02:31
明天到电脑上好好给你说说,看了很多人回复都没说到要害

好啊,谢谢,真心求指点啊,真是找不出问题,再做不出就要找人帮着做了
12楼2014-04-05 00:19:05
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huguangdong

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
windleakey(西门吹雪170代发): 金币+7, 鼓励热心回帖交流 2014-04-06 16:28:21
解答如下:
1 首先检查引物两端酶切位点是否设计正确,有没有失误,尽管从电泳图来看没什么问题,但这是解决问题的第一步。
2 其次,酶切虽然切开了,但是由于你酶切时间过短,你用的那个公司的内切酶效率如何又不知,以我个人经验NEB的内切酶双酶切在4小时以上,TAKARA和MBI的6小时以上,从你的电泳图片来看目的片段切开没问题,但是载体是否之切开了一个酶无法鉴定,所以你要延长酶切事件,尽管你这个实验这方面的原因很小,但是还是要排除。
3 用Solution I 做连接没有问题,本人亲自测试,效率高过T4连接酶,且适合各种连接方式,不仅仅是TA克隆,有问题的是你的连接条件,最佳连接条件是 4 ℃ 24 h,可保证最大限度的连接反应。这个条件是用于各种连接方式,不仅仅是TA,此外体系最好是10ul,目的片段要多,其和载体浓度比在5:1以上,通常我做起来目的片段的浓度如果是100ng/UL,载体40ng/ul。那么就是目的片段4ul,载体1ul,Solution I 5ul。
4 另外,PET28A作为一种低拷贝质粒,转化过程中的感受态细胞要求较高,你是商品化的应该没问题,还有抗性一定要确认好,板子没问题,一些列都排除如果还做不出来,那我也没法子。
13楼2014-04-05 09:50:50
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huguangdong

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

另外,你说关于胶回收洗脱的问题,按照试剂盒操作都没问题,纯化后检测OD值,看是否有有机物、蛋白或RNA污染,这些都是影响下一步实验的因素。

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14楼2014-04-05 09:53:00
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soholj

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
浓度太高了,稀释下,再按载体和片段的比例连接,应该就行,其实只要一点点就可以

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15楼2014-04-05 10:21:05
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windleakey

金虫 (小有名气)

送红花一朵
引用回帖:
14楼: Originally posted by huguangdong at 2014-04-05 09:53:00
另外,你说关于胶回收洗脱的问题,按照试剂盒操作都没问题,纯化后检测OD值,看是否有有机物、蛋白或RNA污染,这些都是影响下一步实验的因素。

感谢解答,引物没问题;酶切我切过pet28a空质粒,和pet28a带着目的基因的(酶切位点也是那两个),切后电泳在一水平,应该可以证明切的效果可以吧,除非出现把粘性末端切除的情况。。。关于连接我也尝试了好多种,都不行;您说的最后一种,是我最担心的,就是污染的问题,我测了OD,发现盐离子浓度很高,所以马上要做下乙醇沉淀试一下;最近问了一个老师,他说连接不上多是因为酶切不好,Takara的这俩酶(Bamh1、Ecor1)一起切应该没啥问题吧?
16楼2014-04-05 20:11:32
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windleakey

金虫 (小有名气)

引用回帖:
15楼: Originally posted by soholj at 2014-04-05 10:21:05
浓度太高了,稀释下,再按载体和片段的比例连接,应该就行,其实只要一点点就可以

感谢回答,片段浓度太高会影响连接吗?
17楼2014-04-05 20:12:25
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huguangdong

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
16楼: Originally posted by windleakey at 2014-04-05 20:11:32
感谢解答,引物没问题;酶切我切过pet28a空质粒,和pet28a带着目的基因的(酶切位点也是那两个),切后电泳在一水平,应该可以证明切的效果可以吧,除非出现把粘性末端切除的情况。。。关于连接我也尝试了好多种,都 ...

TAKARA的内切酶品质没什么问题,那你就要加长酶切时间。
18楼2014-04-05 20:38:44
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fghjkyt

新虫 (正式写手)


【答案】应助回帖


windleakey(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-04-06 16:28:47
我们对经典基因克隆方法进行了小改进, 效果很明显, 特别是对平末端连接,单酶切产物连接,和某些双酶切连接有用:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24613256
由于时间和实验条件有限,水平也有限, 做得不是很好
   但是很简单方便,对你的难题或许有帮助,值得一试。
如果有帮助, 发表论文的时候,一定别忘了引用哦, 谢谢!!!!
19楼2014-04-06 09:24:47
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soholj

至尊木虫 (著名写手)

引用回帖:
17楼: Originally posted by windleakey at 2014-04-05 20:12:25
感谢回答,片段浓度太高会影响连接吗?...

会的,之前我们实验室遇到过,条带很亮,连接两个月都连接不上,后来测浓度,稀释后一下就连接上了~,你试一下
20楼2014-04-08 11:02:24
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