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windleakey金虫 (小有名气)
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[求助]
重组质粒构建 连接转化效率低 求帮助啊 已有1人参与
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我实验是这样的： 目的基因已经连进了T载体，下面往表达载体（pet28a、pGEX-6p-1）里面连； 首先T载体、表达载体分别双酶切： dna 15ul、俩酶各 1ul、buffer 5ul 补水至50，切俩小时。各切两管，回收胶（天根的试剂盒）。 图是胶回收完，跑电泳看看回收效果和浓度。分别是目的片段和俩载体； 连接体系： 载体2、目的片段4、Takara的Solution1 6，12ul体系。载体和目的片段比例也尝试过好几种，效果都一样； 转化的感受态是买的，应该不会有什么问题。 最近转化完总是空板，做了4、5次了，有点找不到原因了。希望大神们给点意见。应该是连接这部分有问题。 还有几个小问题： 回收胶洗脱时为什么不用EB呢，天根回收胶试剂盒的EB是不是TB缓冲液啊？ 连接不好是不是片段浓度还是有点低呢，比marker亮应该大于20ng/ul了，还需要加大酶切体系多回收些吗？ 有人说takara的solution1 效率不好，是吗？  IMG_1395.JPG |
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huguangdong
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【答案】应助回帖
| 另外，你说关于胶回收洗脱的问题，按照试剂盒操作都没问题，纯化后检测OD值，看是否有有机物、蛋白或RNA污染，这些都是影响下一步实验的因素。 |
windleakey14楼2014-04-05 09:53:00
cm8002
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【答案】应助回帖
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gyesang: 金币+4, 鼓励回帖交流！ 2014-04-02 21:19:11
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1、建议做双酶切的时候降低DNA的量，连接不需要太多，只要确保完全切开； 2、做连接，咱还是别那么省，solution1那是T载体试剂盒里的，做其他连接效率不能保证，建议用takara的T4 DNA连接酶或是其他公司的专用连接酶； 3、“回收胶洗脱时为什么不用Elution Buffer？”可以用，Elution Buffer一般就是tris-hcl 缓冲液，不过要是用于连接的话，还是建议用蒸馏水溶，因为buffer里的盐可能会影响后续的连接步骤。 |
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2楼2014-04-02 21:14:58
windleakey
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3楼2014-04-02 21:31:38
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4楼2014-04-03 14:08:05
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