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windleakey

金虫 (小有名气)

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[求助] 重组质粒构建连接转化效率低求帮助啊已有1人参与

我实验是这样的：

目的基因已经连进了T载体，下面往表达载体（pet28a、pGEX-6p-1）里面连；

首先T载体、表达载体分别双酶切：
dna 15ul、俩酶各 1ul、buffer 5ul 补水至50，切俩小时。各切两管，回收胶（天根的试剂盒）。

图是胶回收完，跑电泳看看回收效果和浓度。分别是目的片段和俩载体；

连接体系：
载体2、目的片段4、Takara的Solution1 6，12ul体系。载体和目的片段比例也尝试过好几种，效果都一样；

转化的感受态是买的，应该不会有什么问题。

最近转化完总是空板，做了4、5次了，有点找不到原因了。希望大神们给点意见。应该是连接这部分有问题。

还有几个小问题：
回收胶洗脱时为什么不用EB呢，天根回收胶试剂盒的EB是不是TB缓冲液啊？
连接不好是不是片段浓度还是有点低呢，比marker亮应该大于20ng/ul了，还需要加大酶切体系多回收些吗？
有人说takara的solution1 效率不好，是吗？

IMG_1395.JPG

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1楼 2014-04-02 14:41:32

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fghjkyt

新虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

★
windleakey(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-04-06 16:28:47

我们对经典基因克隆方法进行了小改进，效果很明显，特别是对平末端连接，单酶切产物连接，和某些双酶切连接有用：
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24613256
由于时间和实验条件有限，水平也有限，做得不是很好
但是很简单方便，对你的难题或许有帮助，值得一试。
如果有帮助，发表论文的时候，一定别忘了引用哦，谢谢！！！！

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