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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 重组质粒构建 连接转化效率低 求帮助啊
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windleakey

金虫 (小有名气)

[求助] 重组质粒构建 连接转化效率低 求帮助啊 已有1人参与

我实验是这样的：

目的基因已经连进了T载体，下面往表达载体（pet28a、pGEX-6p-1）里面连；

首先T载体、表达载体分别双酶切：
dna 15ul、俩酶各 1ul、buffer 5ul 补水至50，切俩小时。各切两管，回收胶（天根的试剂盒）。

图是胶回收完，跑电泳看看回收效果和浓度。分别是目的片段和俩载体；

连接体系：
载体2、目的片段4、Takara的Solution1 6，12ul体系。载体和目的片段比例也尝试过好几种，效果都一样；

转化的感受态是买的，应该不会有什么问题。

最近转化完总是空板，做了4、5次了，有点找不到原因了。希望大神们给点意见。应该是连接这部分有问题。

还有几个小问题：
回收胶洗脱时为什么不用EB呢，天根回收胶试剂盒的EB是不是TB缓冲液啊？
连接不好是不是片段浓度还是有点低呢，比marker亮应该大于20ng/ul了，还需要加大酶切体系多回收些吗？
有人说takara的solution1 效率不好，是吗？

重组质粒构建 连接转化效率低 求帮助啊
IMG_1395.JPG
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1楼 2014-04-02 14:41:32
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soholj

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
浓度太高了，稀释下，再按载体和片段的比例连接，应该就行，其实只要一点点就可以

[ 发自小木虫客户端 ]
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15楼2014-04-05 10:21:05
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soholj

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
17楼: Originally posted by windleakey at 2014-04-05 20:12:25
感谢回答，片段浓度太高会影响连接吗？...

会的，之前我们实验室遇到过，条带很亮，连接两个月都连接不上，后来测浓度，稀释后一下就连接上了~,你试一下
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20楼2014-04-08 11:02:24
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