| 查看: 7059 | 回复: 19 | ||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||
windleakey金虫 (小有名气)
|
[求助]
重组质粒构建 连接转化效率低 求帮助啊 已有1人参与
|
|
|
我实验是这样的： 目的基因已经连进了T载体，下面往表达载体（pet28a、pGEX-6p-1）里面连； 首先T载体、表达载体分别双酶切： dna 15ul、俩酶各 1ul、buffer 5ul 补水至50，切俩小时。各切两管，回收胶（天根的试剂盒）。 图是胶回收完，跑电泳看看回收效果和浓度。分别是目的片段和俩载体； 连接体系： 载体2、目的片段4、Takara的Solution1 6，12ul体系。载体和目的片段比例也尝试过好几种，效果都一样； 转化的感受态是买的，应该不会有什么问题。 最近转化完总是空板，做了4、5次了，有点找不到原因了。希望大神们给点意见。应该是连接这部分有问题。 还有几个小问题： 回收胶洗脱时为什么不用EB呢，天根回收胶试剂盒的EB是不是TB缓冲液啊？ 连接不好是不是片段浓度还是有点低呢，比marker亮应该大于20ng/ul了，还需要加大酶切体系多回收些吗？ 有人说takara的solution1 效率不好，是吗？  IMG_1395.JPG |
回复此楼» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有128人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 各位前辈，小虫重组质粒双酶切琼脂糖电泳，没有条带，请求帮助.....
已经有3人回复
- 求助，酶切之后，非但是没有产物，而且连原本的质粒也没跑出来
已经有6人回复
- 连接效率低，重组质粒无法酶切
已经有5人回复
- 质粒构建出了奇怪的现象，实在找不到原因，请大家帮忙看看
已经有10人回复
- 用的pCDNA-5重组质粒，通过测序检验质粒+目的基因是否构建成功
已经有5人回复
- 平末端加A尾连接T载体的问题
已经有14人回复
- 关于使载体平末端环化的问题
已经有14人回复
- 单链DNA和质粒转化大肠杆菌DH5α谁的转化效率高？
已经有5人回复
- 大肠杆菌转化 是热击法转化效率高还是电转化效率高
已经有11人回复
- 求助分子克隆问题——挑不出阳性克隆！
已经有14人回复
- 质粒与片段的连接
已经有9人回复
- 原核表达重组表达载体的连问题
已经有14人回复
- PCR产物纯化后酶切，连接
已经有28人回复
- 克隆做不出来，求帮助
已经有19人回复
- 自杀型质粒如何发生两次重组？
已经有5人回复
- 重组质粒单双酶切结果一样，奇怪了的……
已经有15人回复
- 转化后菌液PCR鉴定，没有目的条带
已经有15人回复
- 质粒转化与表达
已经有19人回复
- 我将1质粒连在BK载体上，但是阳性克隆鉴定一直是阴性，什么原因呢
已经有6人回复
- 一个关于感受态转化效率的问题
已经有11人回复
- 质粒构建时连接的片段总是反方向，求助！
已经有7人回复
- 酶切质粒时，怎样鉴定质粒是否被切开了啊？
已经有6人回复
- 【求助/交流】质粒PCR产物的回收（质粒构建）
已经有11人回复
- 【求助/交流】连接产物转化后菌落PCR正确，提取的质粒却比空质粒还小？
已经有4人回复
- 【求助/交流】重组质粒转化
已经有22人回复
cs2951819
银虫 (小有名气)
- 应助: 9 (幼儿园)
- 金币: 121.1
- 散金: 52
- 帖子: 55
- 在线: 64.8小时
- 虫号: 1199908
- 注册: 2011-02-07
- 性别: GG
- 专业: 食品加工技术
7楼2014-04-04 07:27:30
cm8002
金虫 (小有名气)
- 应助: 11 (小学生)
- 金币: 3615.3
- 红花: 3
- 帖子: 105
- 在线: 162.6小时
- 虫号: 2482047
- 注册: 2013-05-26
- 专业: 自身免疫性疾病
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+4, 鼓励回帖交流！ 2014-04-02 21:19:11
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+4, 鼓励回帖交流！ 2014-04-02 21:19:11
|
1、建议做双酶切的时候降低DNA的量，连接不需要太多，只要确保完全切开； 2、做连接，咱还是别那么省，solution1那是T载体试剂盒里的，做其他连接效率不能保证，建议用takara的T4 DNA连接酶或是其他公司的专用连接酶； 3、“回收胶洗脱时为什么不用Elution Buffer？”可以用，Elution Buffer一般就是tris-hcl 缓冲液，不过要是用于连接的话，还是建议用蒸馏水溶，因为buffer里的盐可能会影响后续的连接步骤。 |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
windleakey2楼2014-04-02 21:14:58
windleakey
金虫 (小有名气)
- 应助: 11 (小学生)
- 金币: 1071.9
- 红花: 1
- 帖子: 94
- 在线: 92.5小时
- 虫号: 1894719
- 注册: 2012-07-16
- 性别: GG
- 专业: 环境微生物学
3楼2014-04-02 21:31:38
cm8002
金虫 (小有名气)
- 应助: 11 (小学生)
- 金币: 3615.3
- 红花: 3
- 帖子: 105
- 在线: 162.6小时
- 虫号: 2482047
- 注册: 2013-05-26
- 专业: 自身免疫性疾病
4楼2014-04-03 14:08:05
