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windleakey金虫 (小有名气)
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[求助]
重组质粒构建 连接转化效率低 求帮助啊 已有1人参与
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我实验是这样的： 目的基因已经连进了T载体，下面往表达载体（pet28a、pGEX-6p-1）里面连； 首先T载体、表达载体分别双酶切： dna 15ul、俩酶各 1ul、buffer 5ul 补水至50，切俩小时。各切两管，回收胶（天根的试剂盒）。 图是胶回收完，跑电泳看看回收效果和浓度。分别是目的片段和俩载体； 连接体系： 载体2、目的片段4、Takara的Solution1 6，12ul体系。载体和目的片段比例也尝试过好几种，效果都一样； 转化的感受态是买的，应该不会有什么问题。 最近转化完总是空板，做了4、5次了，有点找不到原因了。希望大神们给点意见。应该是连接这部分有问题。 还有几个小问题： 回收胶洗脱时为什么不用EB呢，天根回收胶试剂盒的EB是不是TB缓冲液啊？ 连接不好是不是片段浓度还是有点低呢，比marker亮应该大于20ng/ul了，还需要加大酶切体系多回收些吗？ 有人说takara的solution1 效率不好，是吗？  IMG_1395.JPG |
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cs2951819
银虫 (小有名气)
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7楼2014-04-04 07:27:30