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ruchang2013

铁虫 (初入文坛)

[求助] 有有效的方法检验酶切效率吗 已有2人参与

最近的单酶切实验一直连接不上核酸片段。载体是pTKIP-cat,单酶切位点是ApaI,核酸片段2端也设计了ApaI酶切位点。我发觉是不是载体像平末端一样容易自连,去磷酸化延长至45min也不管事.我认为若果酶切不彻底,那么导致去磷酸化等于白做,而且若是有一部分酶切成功,去磷酸化过头,那么就等于把酶切好的载体去坏了
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银虫 (小有名气)

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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-05-20 11:25:48
ruchang2013: 金币+2, 有帮助 2014-05-22 19:03:33
加大一下载体的量,延长酶切时间。
ps:考察酶切效率,方法倒是有,不过又费事又不准确,你个简单酶切不至于这么麻烦。
pps:所有的酶其实都不像它说明书上描述的那样高效
2楼2014-05-20 10:48:42
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万丽丽081222

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-05-20 11:25:57
ruchang2013: 金币+3 2014-05-22 19:03:42
你酶切结束后,点上loading buffer,然后跑胶,切胶纯化后在连接。
你做这个单酶切的目的是什么啊?pTKIP-cat这个载体有什么特殊的性质吗?如果实在不行就换载体。
learnenglish
3楼2014-05-20 11:16:57
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再来一次

银虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 万丽丽081222 at 2014-05-20 11:16:57
你酶切结束后,点上loading buffer,然后跑胶,切胶纯化后在连接。
你做这个单酶切的目的是什么啊?pTKIP-cat这个载体有什么特殊的性质吗?如果实在不行就换载体。

纯化后载体回收经常容易丢失啊,妹子
4楼2014-05-21 14:18:51
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