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shiyiyaya金虫 (正式写手)
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克隆失败原因：NdeI+KpnI？ 已有4人参与
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现有: 15K质粒pA，NdeI+KpnI双酶切之后产生11K+4K（回收11K做载体）； 6.7K质粒pB，NdeI+KpnI双酶切之后产生4K+2.7K（回收4K做外源DNA）; 连接回收的11K和4K。 结果失败：经多种方案鉴定，转化长出来的重组子都是质粒pB. 我已经尝试单酶切*2次、PCR扩增4K片段，重新转化质粒，挑单克隆再继续…都不行。感觉就像pB没有切干净。 请问虫友，可否遇到类似情况？NdeI+KpnI，这两个酶的活性就是低吗？ 谢谢帮忙！ |
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atlanticwi
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............. 首先，酶自身不会有问题，其次，我不明白的是这个问题，你PCR 4K片段，再做连接，会不会长出来的也是pB质粒？如果是，污染是可能性很大，我估计那个7k左右的质粒其实并不是pB。我以前遇到这种情况，双酶切载体（载体上带片段，所以双酶切可以分辨清楚），用了一个不加片段而加ddH2O的对照，发现长出来的很多克隆，这些克隆用一个酶酶切是原来载体的样子，用另一个酶酶切就不对了。所以我怀疑污染的可能性要大于载体自连的可能性。 所以针对你的情况，我的建议是这样，把4K的片段克隆到T载体上，然后用T载体上酶切下来的片段和11K做连接。绕过对pB质粒进行的直接操作。另一个，做构建尽量选用硅胶柱做质粒提取是比较合适的。 |
8楼2014-03-06 06:21:13
鬼羽帝魂
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4楼2014-03-05 22:53:08
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5楼2014-03-05 23:02:38
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既然你都切开了，那就是连接酶的问题。不知道你这个质粒的抗性如何。 此外，没图没真相啊。建议你跑一个pB没有酶切的，pB单酶切，pB双酶切的对比一下 既然出现两条带，不太可能是没切干净，感觉。 还有内切酶不行的话换个牌子的内切酶试一下。但是个人觉得你用的那个牌子的内切酶还是很强悍的。我构建过3个载体，都是用Fe***的。 有一点我很好奇，为啥你内切酶用Fe****的，连接酶用N**的。 质粒有没有切干净我个人感觉看电泳图就能说明问题。我质粒单酶切都是单一条带，没有切过的质粒都是2-3条带。 另外你说都是重组子pB，这个结论你是怎么得出来的？？测序验证？PCR检验？ 质粒、RNA跑电泳的话marker纯粹仅仅作为参照，并不能绝对反映出质粒或是RNA的真实大小！！ |
6楼2014-03-05 23:51:51
7楼2014-03-06 00:02:47
shiyiyaya
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