| 查看: 2614 | 回复: 20 | ||
shiyiyaya金虫 (正式写手)
|
[求助]
克隆失败原因：NdeI+KpnI？ 已有4人参与
|
|
|
现有: 15K质粒pA，NdeI+KpnI双酶切之后产生11K+4K（回收11K做载体）； 6.7K质粒pB，NdeI+KpnI双酶切之后产生4K+2.7K（回收4K做外源DNA）; 连接回收的11K和4K。 结果失败：经多种方案鉴定，转化长出来的重组子都是质粒pB. 我已经尝试单酶切*2次、PCR扩增4K片段，重新转化质粒，挑单克隆再继续…都不行。感觉就像pB没有切干净。 请问虫友，可否遇到类似情况？NdeI+KpnI，这两个酶的活性就是低吗？ 谢谢帮忙！ |
回复此楼» 猜你喜欢
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有298人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
-
氢氧化钾活化操作
已经有18人回复
-
散金
已经有68人回复
-
生物质超级电容器
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 基因克隆失败原因，求助！
已经有10人回复
- Hind111 与 Not1双酶切请教 急急急！！！
已经有13人回复
atlanticwi
金虫 (正式写手)
琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
- MolEPI: 25
- 应助: 138 (高中生)
- 金币: 141.2
- 散金: 350
- 红花: 13
- 帖子: 536
- 在线: 313.2小时
- 虫号: 1099992
- 注册: 2010-09-15
- 专业: 植物生理与生化
★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-03-06 12:38:32
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-03-06 12:38:32
|
............. 首先，酶自身不会有问题，其次，我不明白的是这个问题，你PCR 4K片段，再做连接，会不会长出来的也是pB质粒？如果是，污染是可能性很大，我估计那个7k左右的质粒其实并不是pB。我以前遇到这种情况，双酶切载体（载体上带片段，所以双酶切可以分辨清楚），用了一个不加片段而加ddH2O的对照，发现长出来的很多克隆，这些克隆用一个酶酶切是原来载体的样子，用另一个酶酶切就不对了。所以我怀疑污染的可能性要大于载体自连的可能性。 所以针对你的情况，我的建议是这样，把4K的片段克隆到T载体上，然后用T载体上酶切下来的片段和11K做连接。绕过对pB质粒进行的直接操作。另一个，做构建尽量选用硅胶柱做质粒提取是比较合适的。 |
8楼2014-03-06 06:21:13
鬼羽帝魂
木虫 (著名写手)
- 应助: 183 (高中生)
- 金币: 3100.2
- 散金: 19
- 红花: 12
- 帖子: 1427
- 在线: 186.8小时
- 虫号: 2538789
- 注册: 2013-07-09
- 专业: 生物物理、生物化学与分子
12楼2014-03-06 10:25:35
2楼2014-03-05 20:19:38
lvbobo823
铁杆木虫 (正式写手)
- 应助: 363 (硕士)
- 金币: 7753.3
- 散金: 15
- 红花: 9
- 帖子: 751
- 在线: 189.4小时
- 虫号: 819723
- 注册: 2009-07-31
- 性别: GG
- 专业: 植物遗传学
3楼2014-03-05 20:54:57
shiyiyaya
金虫 (正式写手)
- 应助: 36 (小学生)
- 金币: 1276.4
- 散金: 279
- 红花: 8
- 帖子: 301
- 在线: 63.2小时
- 虫号: 871992
- 注册: 2009-10-14
- 性别: GG
- 专业: 病毒学
4楼2014-03-05 22:53:08
shiyiyaya
金虫 (正式写手)
- 应助: 36 (小学生)
- 金币: 1276.4
- 散金: 279
- 红花: 8
- 帖子: 301
- 在线: 63.2小时
- 虫号: 871992
- 注册: 2009-10-14
- 性别: GG
- 专业: 病毒学
5楼2014-03-05 23:02:38
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
shiyiyaya: 金币+2, ★有帮助 2014-03-06 08:15:32
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-03-06 12:38:57
感谢参与，应助指数 +1
shiyiyaya: 金币+2, ★有帮助 2014-03-06 08:15:32
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-03-06 12:38:57
|
既然你都切开了，那就是连接酶的问题。不知道你这个质粒的抗性如何。 此外，没图没真相啊。建议你跑一个pB没有酶切的，pB单酶切，pB双酶切的对比一下 既然出现两条带，不太可能是没切干净，感觉。 还有内切酶不行的话换个牌子的内切酶试一下。但是个人觉得你用的那个牌子的内切酶还是很强悍的。我构建过3个载体，都是用Fe***的。 有一点我很好奇，为啥你内切酶用Fe****的，连接酶用N**的。 质粒有没有切干净我个人感觉看电泳图就能说明问题。我质粒单酶切都是单一条带，没有切过的质粒都是2-3条带。 另外你说都是重组子pB，这个结论你是怎么得出来的？？测序验证？PCR检验？ 质粒、RNA跑电泳的话marker纯粹仅仅作为参照，并不能绝对反映出质粒或是RNA的真实大小！！ |
6楼2014-03-05 23:51:51
7楼2014-03-06 00:02:47
shiyiyaya
金虫 (正式写手)
- 应助: 36 (小学生)
- 金币: 1276.4
- 散金: 279
- 红花: 8
- 帖子: 301
- 在线: 63.2小时
- 虫号: 871992
- 注册: 2009-10-14
- 性别: GG
- 专业: 病毒学
9楼2014-03-06 08:17:29
shiyiyaya
金虫 (正式写手)
- 应助: 36 (小学生)
- 金币: 1276.4
- 散金: 279
- 红花: 8
- 帖子: 301
- 在线: 63.2小时
- 虫号: 871992
- 注册: 2009-10-14
- 性别: GG
- 专业: 病毒学
10楼2014-03-06 08:21:04
