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shiyiyaya金虫 (正式写手)
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克隆失败原因：NdeI+KpnI？已有4人参与
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现有: 15K质粒pA，NdeI+KpnI双酶切之后产生11K+4K（回收11K做载体）； 6.7K质粒pB，NdeI+KpnI双酶切之后产生4K+2.7K（回收4K做外源DNA）; 连接回收的11K和4K。 结果失败：经多种方案鉴定，转化长出来的重组子都是质粒pB. 我已经尝试单酶切*2次、PCR扩增4K片段，重新转化质粒，挑单克隆再继续…都不行。感觉就像pB没有切干净。 请问虫友，可否遇到类似情况？NdeI+KpnI，这两个酶的活性就是低吗？ 谢谢帮忙！ |
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atlanticwi
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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-03-06 12:38:32
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-03-06 12:38:32
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............. 首先，酶自身不会有问题，其次，我不明白的是这个问题，你PCR 4K片段，再做连接，会不会长出来的也是pB质粒？如果是，污染是可能性很大，我估计那个7k左右的质粒其实并不是pB。我以前遇到这种情况，双酶切载体（载体上带片段，所以双酶切可以分辨清楚），用了一个不加片段而加ddH2O的对照，发现长出来的很多克隆，这些克隆用一个酶酶切是原来载体的样子，用另一个酶酶切就不对了。所以我怀疑污染的可能性要大于载体自连的可能性。 所以针对你的情况，我的建议是这样，把4K的片段克隆到T载体上，然后用T载体上酶切下来的片段和11K做连接。绕过对pB质粒进行的直接操作。另一个，做构建尽量选用硅胶柱做质粒提取是比较合适的。 |
8楼2014-03-06 06:21:13
2楼2014-03-05 20:19:38
lvbobo823
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4楼2014-03-05 22:53:08