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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 基因克隆失败原因，求助！
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陈彦利

铁虫 (小有名气)

[交流] 基因克隆失败原因，求助！

我们要克隆一个目的基因，结果PCR后电泳根本就没有条带，为什么呀，请高手帮忙分析原因
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1楼 2013-04-27 14:40:22
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
陈彦利(金币+1): 谢谢参与
陈彦利(gyesang代发): 金币+2, 鼓励发贴交流，为楼主问题解决提供可能的线索！ 2013-04-27 15:08:55
从什么模板克隆，基因组还是cDNA？模板是否有问题，PCR是否设置了正对照？引物的退火温度是否进行了优化？
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2楼2013-04-27 14:50:06
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德国工兵铲

金虫 (小有名气)
★ ★
陈彦利(金币+1): 谢谢参与
陈彦利(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-04-27 15:09:07
体系中模板、引物、dntp、水都有可能有问题，还有镁离子浓度

程序中退火温度也比较重要，你什么都没有给，不好说啊！
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3楼2013-04-27 14:54:01
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我很快乐3A87

新虫 (小有名气)
★
陈彦利(金币+1): 谢谢参与
我最近也正在做3'race，跑了好几次也没结果，好像最后都只是引物二聚体。maker本来应该点2000bp的，结果点错了点成15000的，目的片段本应该是400-500bp，请各位高手帮我分析分析这个电泳图，谢了。

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4楼2013-04-27 15:11:25
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陈彦利

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-04-27 14:50:06
从什么模板克隆，基因组还是cDNA？模板是否有问题，PCR是否设置了正对照？引物的退火温度是否进行了优化？

　　以反转录得到的双链cDNA为模板，设计特异性引物，Forward primer：5’-GGCATCCATGTCGCATCTGT-3’；Reverse primer :5’-TCTGACCCTATTGAGCCCTCT-3’。通过PCR扩增获得目的基因OspHT7。
取0.5ml PCR管，一次加入下列试剂：
反应体系            25uL
Tamplate cDNA       0.75uL         
ddH2O              16.5uL
10×PCR Buffer       2.5uL
Mg2+               1uL
dNTP               2uL
primer  Forward      1uL
       Reverse       1uL
Taq                 0.25uL

设定PCR程序：
PCR循环:
94℃ 预变性5min
94℃ 60s
55℃ 60s   30个循环
72℃ 90s
72℃ 10min
4℃ 保存。
    电泳鉴定：采用1%的琼脂糖凝胶电泳进行分析，其中电泳加样体积均为10uLDNAMarker为D2000。紫外灯下观察结果。
　　拍照观察：采用凝胶图像分析系统，对电泳图条带进行拍照分析。
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5楼2013-04-27 15:13:06
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陈彦利

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 德国工兵铲 at 2013-04-27 14:54:01
体系中模板、引物、dntp、水都有可能有问题，还有镁离子浓度

程序中退火温度也比较重要，你什么都没有给，不好说啊！

　　以反转录得到的双链cDNA为模板，设计特异性引物，Forward primer：5’-GGCATCCATGTCGCATCTGT-3’；Reverse primer :5’-TCTGACCCTATTGAGCCCTCT-3’。通过PCR扩增获得目的基因OspHT7。
取0.5ml PCR管，一次加入下列试剂：
反应体系            25uL
Tamplate cDNA       0.75uL         
ddH2O              16.5uL
10×PCR Buffer       2.5uL
Mg2+               1uL
dNTP               2uL
primer  Forward      1uL
       Reverse       1uL
Taq                 0.25uL

设定PCR程序：
PCR循环:
94℃ 预变性5min
94℃ 60s
55℃ 60s   30个循环
72℃ 90s
72℃ 10min
4℃ 保存。
    电泳鉴定：采用1%的琼脂糖凝胶电泳进行分析，其中电泳加样体积均为10uLDNAMarker为D2000。紫外灯下观察结果。
　　拍照观察：采用凝胶图像分析系统，对电泳图条带进行拍照分析。
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6楼2013-04-27 15:13:19
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德国工兵铲

金虫 (小有名气)
★
陈彦利(gyesang代发): 金币+1, 鼓励应助交流！ 2013-04-28 03:03:03
如果你确定模板没有问题（就是前期RNA提的不错，反转录也没有问题），你可以先做一个退火温度梯度。因为你用错了MARKER，从电泳图上也看不清楚。你电泳时间应该比较长了，如果目的条带很弱的话，有可能就看不到了。

另外，用5ul点样就可以了，不用那么多的，上样量太多跑的条带不好看。
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7楼2013-04-27 16:08:22
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-04-28 03:03:16
引用回帖:
5楼: Originally posted by 陈彦利 at 2013-04-27 15:13:06
　　以反转录得到的双链cDNA为模板，设计特异性引物，Forward primer：5’-GGCATCCATGTCGCATCTGT-3’；Reverse primer :5’-TCTGACCCTATTGAGCCCTCT-3’。通过PCR扩增获得目的基因OspHT7。
取0.5ml PCR管，一次加 ...

是否检测了cDNA模板的浓度？此外，引物是否好用？PCR时是否做了其它基因为对照？镁离子、引物、dNTP的浓度是多少？
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9楼2013-04-28 02:58:03
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sd3824289

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
中间有可能存在的问题有很多，不过建议你可以试一下PCR Mix，如果楼主要克隆的目的片段较大，还是建议用pfu taq酶，提高保真性！如果还是不行建议楼主从引物角度考虑一下，换一下引物什么的！祝试验顺利！
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10楼2013-04-29 14:14:31
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zhyn2012

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
30个循环是在第几步上啊
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11楼2013-04-29 16:06:15
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yingying15888楼
2013-04-27 17:29   回复  
陈彦利(金币+1): 谢谢参与
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