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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 基因克隆失败原因，求助！
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陈彦利

铁虫 (小有名气)

[交流] 基因克隆失败原因，求助！

我们要克隆一个目的基因，结果PCR后电泳根本就没有条带，为什么呀，请高手帮忙分析原因
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1楼 2013-04-27 14:40:22
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我很快乐3A87

新虫 (小有名气)
★
陈彦利(金币+1): 谢谢参与
我最近也正在做3'race，跑了好几次也没结果，好像最后都只是引物二聚体。maker本来应该点2000bp的，结果点错了点成15000的，目的片段本应该是400-500bp，请各位高手帮我分析分析这个电泳图，谢了。

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4楼2013-04-27 15:11:25
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
陈彦利(金币+1): 谢谢参与
陈彦利(gyesang代发): 金币+2, 鼓励发贴交流，为楼主问题解决提供可能的线索！ 2013-04-27 15:08:55
从什么模板克隆，基因组还是cDNA？模板是否有问题，PCR是否设置了正对照？引物的退火温度是否进行了优化？
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2楼2013-04-27 14:50:06
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德国工兵铲

金虫 (小有名气)
★ ★
陈彦利(金币+1): 谢谢参与
陈彦利(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-04-27 15:09:07
体系中模板、引物、dntp、水都有可能有问题，还有镁离子浓度

程序中退火温度也比较重要，你什么都没有给，不好说啊！
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3楼2013-04-27 14:54:01
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陈彦利

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-04-27 14:50:06
从什么模板克隆，基因组还是cDNA？模板是否有问题，PCR是否设置了正对照？引物的退火温度是否进行了优化？

　　以反转录得到的双链cDNA为模板，设计特异性引物，Forward primer：5’-GGCATCCATGTCGCATCTGT-3’；Reverse primer :5’-TCTGACCCTATTGAGCCCTCT-3’。通过PCR扩增获得目的基因OspHT7。
取0.5ml PCR管，一次加入下列试剂：
反应体系            25uL
Tamplate cDNA       0.75uL         
ddH2O              16.5uL
10×PCR Buffer       2.5uL
Mg2+               1uL
dNTP               2uL
primer  Forward      1uL
       Reverse       1uL
Taq                 0.25uL

设定PCR程序：
PCR循环:
94℃ 预变性5min
94℃ 60s
55℃ 60s   30个循环
72℃ 90s
72℃ 10min
4℃ 保存。
    电泳鉴定：采用1%的琼脂糖凝胶电泳进行分析，其中电泳加样体积均为10uLDNAMarker为D2000。紫外灯下观察结果。
　　拍照观察：采用凝胶图像分析系统，对电泳图条带进行拍照分析。
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5楼2013-04-27 15:13:06
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