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nnsulei

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】基因组中克隆启动子 已有7人参与

我要从番茄基因组中克隆一启动子大概2200bp,怎么也P不出来,好不容易偶尔P出来条带还很弱,承蒙各位大侠赐教啊怎么回事呢~~
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努力做就有结果~
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

★ ★ ★
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reasonspare(金币+2):谢谢分享。 2010-06-08 06:14:24
启动子GC含量比较低,设计引物的时候设计长一点看看,我一般24-26 bp左右比较容易就P出来了。
Thank-you,so-blue.
2楼2010-06-07 23:10:17
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exon2002

铁杆木虫 (著名写手)

★
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我用35bp以上的引物,扩增没问题。
3楼2010-06-08 06:51:10
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surferl

铜虫 (正式写手)

★
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但因要扩增全长,设计引物时收到序列的限制,扩增时可以用温度梯度,或者二次扩证
4楼2010-06-08 08:44:05
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austin2008

铁杆木虫 (著名写手)

★
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最好采用高保真的酶PCR,不然出错率还是比较高的
优秀是一种习惯;生命是一种过程;放弃是一种智慧;缺点是一种恩惠!
5楼2010-06-08 09:37:05
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ququr008

金虫 (小有名气)

★ ★ ★ ★
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scelab(金币+3):热心虫友,欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-06-08 22:33:39
从复杂基因组环境扩增一段启动子常常会遇到扩不出来,是很正常的。以上所说的各种方法都可以用来一试,你自己还可以想出很多的办法,没有绝对有效的办法,如果有钱,你甚至可以用合成的办法,也有人用分段扩增再连接的办法。只要扩出来有目的片段大小的带,并且条带清晰就好办。至于信号弱一点,可以加大扩增量(管数)或者调整扩增条件,来解决。只要扩出了目的片段,就可以采用T载体等办法构入载体。
6楼2010-06-08 10:03:17
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yuqianswim

银虫 (小有名气)

★
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我也在扩启动子,3400bp,一个月了也没有什么进展,主要是杂带太多,而且和目的条带距离很近,连切胶都不好切,移植郁闷中,下面附上一张图,本人认为“1”对应的泳道,从上数,第3条为我的目的条带大小。我试过提高温度,减少模板用量,都不行,我设计的引物是20bp左右。pcr体系20微升:buffer:2微升,dNTP:2.4,引物各1微升,模板:基因组DNA:0.4微升,LA酶:0.2。请各位大侠指教

图片1.jpg

7楼2013-02-27 17:06:55
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haitian0625

金虫 (小有名气)

★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
楼上应该让公司重新合成引物;若是PCR结果像marker一样了,很有可能是引物合成失败。
8楼2013-02-27 19:14:39
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