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陈彦利

铁虫 (小有名气)


[交流] 基因克隆失败原因,求助!

我们要克隆一个目的基因,结果PCR后电泳根本就没有条带,为什么呀,请高手帮忙分析原因
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)



gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流! 2013-04-28 03:03:16
引用回帖:
5楼: Originally posted by 陈彦利 at 2013-04-27 15:13:06
  以反转录得到的双链cDNA为模板,设计特异性引物,Forward primer:5’-GGCATCCATGTCGCATCTGT-3’;Reverse primer :5’-TCTGACCCTATTGAGCCCTCT-3’。通过PCR扩增获得目的基因OspHT7。
取0.5ml PCR管,一次加 ...

是否检测了cDNA模板的浓度?此外,引物是否好用?PCR时是否做了其它基因为对照?镁离子、引物、dNTP的浓度是多少?
9楼2013-04-28 02:58:03
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)


★ ★ ★
陈彦利(金币+1): 谢谢参与
陈彦利(gyesang代发): 金币+2, 鼓励发贴交流,为楼主问题解决提供可能的线索! 2013-04-27 15:08:55
从什么模板克隆,基因组还是cDNA?模板是否有问题,PCR是否设置了正对照?引物的退火温度是否进行了优化?
2楼2013-04-27 14:50:06
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德国工兵铲

金虫 (小有名气)


★ ★
陈彦利(金币+1): 谢谢参与
陈彦利(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖交流! 2013-04-27 15:09:07
体系中模板、引物、dntp、水都有可能有问题,还有镁离子浓度

程序中退火温度也比较重要,你什么都没有给,不好说啊!
3楼2013-04-27 14:54:01
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我很快乐3A87

新虫 (小有名气)



陈彦利(金币+1): 谢谢参与
我最近也正在做3'race,跑了好几次也没结果,好像最后都只是引物二聚体。maker本来应该点2000bp的,结果点错了点成15000的,目的片段本应该是400-500bp,请各位高手帮我分析分析这个电泳图,谢了。

B1[LMTHM4J4PP%}5_Y7BJ[8.jpg

4楼2013-04-27 15:11:25
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