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陈彦利

铁虫 (小有名气)

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[交流] 基因克隆失败原因，求助！

我们要克隆一个目的基因，结果PCR后电泳根本就没有条带，为什么呀，请高手帮忙分析原因

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1楼 2013-04-27 14:40:22

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陈彦利

铁虫 (小有名气)

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引用回帖:

3楼: Originally posted by 德国工兵铲 at 2013-04-27 14:54:01
体系中模板、引物、dntp、水都有可能有问题，还有镁离子浓度

程序中退火温度也比较重要，你什么都没有给，不好说啊！

　　以反转录得到的双链cDNA为模板，设计特异性引物，Forward primer：5’-GGCATCCATGTCGCATCTGT-3’；Reverse primer :5’-TCTGACCCTATTGAGCCCTCT-3’。通过PCR扩增获得目的基因OspHT7。
取0.5ml PCR管，一次加入下列试剂：
反应体系          25uL
Tamplate cDNA    0.75uL
ddH2O             16.5uL
10×PCR Buffer    2.5uL
Mg2+             1uL
dNTP             2uL
primer  Forward    1uL
   Reverse    1uL
Taq                0.25uL

设定PCR程序：
PCR循环:
94℃ 预变性5min
94℃ 60s
55℃ 60s 30个循环
72℃ 90s
72℃ 10min
4℃ 保存。
电泳鉴定：采用1%的琼脂糖凝胶电泳进行分析，其中电泳加样体积均为10uLDNAMarker为D2000。紫外灯下观察结果。
　　拍照观察：采用凝胶图像分析系统，对电泳图条带进行拍照分析。