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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 基因克隆失败原因，求助！
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陈彦利

铁虫 (小有名气)

[交流] 基因克隆失败原因，求助！

我们要克隆一个目的基因，结果PCR后电泳根本就没有条带，为什么呀，请高手帮忙分析原因
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1楼 2013-04-27 14:40:22
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德国工兵铲

金虫 (小有名气)
★
陈彦利(gyesang代发): 金币+1, 鼓励应助交流！ 2013-04-28 03:03:03
如果你确定模板没有问题（就是前期RNA提的不错，反转录也没有问题），你可以先做一个退火温度梯度。因为你用错了MARKER，从电泳图上也看不清楚。你电泳时间应该比较长了，如果目的条带很弱的话，有可能就看不到了。

另外，用5ul点样就可以了，不用那么多的，上样量太多跑的条带不好看。
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7楼2013-04-27 16:08:22
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
陈彦利(金币+1): 谢谢参与
陈彦利(gyesang代发): 金币+2, 鼓励发贴交流，为楼主问题解决提供可能的线索！ 2013-04-27 15:08:55
从什么模板克隆，基因组还是cDNA？模板是否有问题，PCR是否设置了正对照？引物的退火温度是否进行了优化？
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2楼2013-04-27 14:50:06
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德国工兵铲

金虫 (小有名气)
★ ★
陈彦利(金币+1): 谢谢参与
陈彦利(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-04-27 15:09:07
体系中模板、引物、dntp、水都有可能有问题，还有镁离子浓度

程序中退火温度也比较重要，你什么都没有给，不好说啊！
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3楼2013-04-27 14:54:01
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我很快乐3A87

新虫 (小有名气)
★
陈彦利(金币+1): 谢谢参与
我最近也正在做3'race，跑了好几次也没结果，好像最后都只是引物二聚体。maker本来应该点2000bp的，结果点错了点成15000的，目的片段本应该是400-500bp，请各位高手帮我分析分析这个电泳图，谢了。

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4楼2013-04-27 15:11:25
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