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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 克隆失败原因：NdeI+KpnI？
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shiyiyaya

金虫 (正式写手)

[求助] 克隆失败原因：NdeI+KpnI？ 已有4人参与

现有:
15K质粒pA，NdeI+KpnI双酶切之后产生11K+4K（回收11K做载体）；
6.7K质粒pB，NdeI+KpnI双酶切之后产生4K+2.7K（回收4K做外源DNA）;

连接回收的11K和4K。

结果失败：经多种方案鉴定，转化长出来的重组子都是质粒pB.

我已经尝试单酶切*2次、PCR扩增4K片段，重新转化质粒，挑单克隆再继续…都不行。感觉就像pB没有切干净。

请问虫友，可否遇到类似情况？NdeI+KpnI，这两个酶的活性就是低吗？

谢谢帮忙！
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1楼 2014-03-05 17:41:59
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-03-06 12:38:32
.............
    首先，酶自身不会有问题，其次，我不明白的是这个问题，你PCR 4K片段，再做连接，会不会长出来的也是pB质粒？如果是，污染是可能性很大，我估计那个7k左右的质粒其实并不是pB。我以前遇到这种情况，双酶切载体（载体上带片段，所以双酶切可以分辨清楚），用了一个不加片段而加ddH2O的对照，发现长出来的很多克隆，这些克隆用一个酶酶切是原来载体的样子，用另一个酶酶切就不对了。所以我怀疑污染的可能性要大于载体自连的可能性。
  所以针对你的情况，我的建议是这样，把4K的片段克隆到T载体上，然后用T载体上酶切下来的片段和11K做连接。绕过对pB质粒进行的直接操作。另一个，做构建尽量选用硅胶柱做质粒提取是比较合适的。
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Let God do with it as He wills
8楼2014-03-06 06:21:13
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-03-06 12:39:30
感觉你的pB没有酶切完全。或者 回收胶的时候把2.7K的也给切了一些。建议跑胶低电压，高浓度胶，长时间后切胶。
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12楼2014-03-06 10:25:35
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普通回帖

三蛰

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-03-05 22:48:14
shiyiyaya: 金币+2, ★有帮助 2014-03-05 23:02:49
shiyiyaya: 金币+2, ★有帮助 2014-03-06 20:28:28
酶切的话，不存在那种酶的酶活性问题，有的只是不同厂家的酶质量问题，另外存放等影响因素。当然操作时添加适当的量也是相当重要的。我觉得你说说你的酶切和连接具体操作会有助于大家对你进行分析。
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我不会！
2楼2014-03-05 20:19:38
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-03-05 22:48:20
shiyiyaya: 金币+2, ★有帮助 2014-03-05 22:53:18
建议你换换新酶分别酶切，每次酶切跑个胶看看有没有切完全，转化时加一个酶切对照看看有没有菌生长，没长说明切完全，长了但比连接产物少很多表明还可以挑选出阳性菌。
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hehe
3楼2014-03-05 20:54:57
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shiyiyaya

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lvbobo823 at 2014-03-05 20:54:57
建议你换换新酶分别酶切，每次酶切跑个胶看看有没有切完全，转化时加一个酶切对照看看有没有菌生长，没长说明切完全，长了但比连接产物少很多表明还可以挑选出阳性菌。

我试过。双酶切之后，电泳时明显切开两条带。与未酶切的质粒一起跑，条带大小明显不同，只是有一条与4K大小类似。
取4k片段直接转化，也长出来过，鉴定之后也是原来的质粒，7K左右。
我还是怀疑有一些酶切干净的质粒再里面，可是我降低质粒量，增加酶切时间等等，都不成。
未解啊！
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4楼2014-03-05 22:53:08
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shiyiyaya

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 三蛰 at 2014-03-05 20:19:38
酶切的话，不存在那种酶的酶活性问题，有的只是不同厂家的酶质量问题，另外存放等影响因素。当然操作时添加适当的量也是相当重要的。我觉得你说说你的酶切和连接具体操作会有助于大家对你进行分析。

碱裂解法小提质粒，外源DNA切于2ug质粒，载体片段切于800ng质粒，酶切总体系30ul，
10U KpnI，Fermentas, FD Buffer; 10U NdeI, Thermo scientific, o buffer.

酶切2h，条带清晰、干净。凝胶回收柱回收（生工的）。

载体片段溶于30ul TE，外源片段溶于15ul ddH2O.
连接使用NEB T4DLig，10ul体系，载体取1ul，外源全部用上，buffer、水补齐。
16度过夜、转化、鉴定。

一般来说，12个转化子，10个一样，都是外源的原始质粒，7K左右大小。其余的也不正确。

求解啊！
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5楼2014-03-05 23:02:38
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ifyousee

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
shiyiyaya: 金币+2, ★有帮助 2014-03-06 08:15:32
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-03-06 12:38:57
既然你都切开了，那就是连接酶的问题。不知道你这个质粒的抗性如何。
此外，没图没真相啊。建议你跑一个pB没有酶切的，pB单酶切，pB双酶切的对比一下
既然出现两条带，不太可能是没切干净，感觉。
还有内切酶不行的话换个牌子的内切酶试一下。但是个人觉得你用的那个牌子的内切酶还是很强悍的。我构建过3个载体，都是用Fe***的。
有一点我很好奇，为啥你内切酶用Fe****的，连接酶用N**的。

质粒有没有切干净我个人感觉看电泳图就能说明问题。我质粒单酶切都是单一条带，没有切过的质粒都是2-3条带。

另外你说都是重组子pB，这个结论你是怎么得出来的？？测序验证？PCR检验？
质粒、RNA跑电泳的话marker纯粹仅仅作为参照，并不能绝对反映出质粒或是RNA的真实大小！！
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6楼2014-03-05 23:51:51
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ifyousee

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by shiyiyaya at 2014-03-05 23:02:38
碱裂解法小提质粒，外源DNA切于2ug质粒，载体片段切于800ng质粒，酶切总体系30ul，
10U KpnI，Fermentas, FD Buffer; 10U NdeI, Thermo scientific, o buffer.

酶切2h，条带清晰、干净。凝胶回收柱回收（生工的 ...

你酶切割胶回收完以后有没有测一下得到的DNA浓度？
因为连接的工作量不大，所以你可以载体：片段按弄个比例梯度出来。
鉴定的话可以酶切、PCR鉴定，但是PCR鉴定更快、效率。推荐PCR鉴定。
至于你跑电泳胶鉴定的话你知道质粒有3条带，分别是开环、线性、超螺旋，你这样判断大小是7K左右是极度不科学的。
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7楼2014-03-06 00:02:47
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shiyiyaya

金虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by ifyousee at 2014-03-05 23:51:51
既然你都切开了，那就是连接酶的问题。不知道你这个质粒的抗性如何。
此外，没图没真相啊。建议你跑一个pB没有酶切的，pB单酶切，pB双酶切的对比一下
既然出现两条带，不太可能是没切干净，感觉。
还有内切酶不行 ...

重组子经4种酶切方案鉴定过，与pB一致。
另，我说的~7K，是经过单切之后，与pB大小一致。并不是直接说质粒等的大小。

我头疼的就是，明明切的干净，可结果却貌似没有切干净。
如果说存在污染，后续我重新将pB转化，挑单克隆，也没成。
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9楼2014-03-06 08:17:29
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shiyiyaya

金虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by atlanticwi at 2014-03-06 06:21:13
.............
    首先，酶自身不会有问题，其次，我不明白的是这个问题，你PCR 4K片段，再做连接，会不会长出来的也是pB质粒？如果是，污染是可能性很大，我估计那个7k左右的质粒其实并不是pB。我以前遇到这种情 ...

这个我觉得很有可能。
我再试试，大家说的原因，我倒是试过，可能其中有些问题没有发现。
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10楼2014-03-06 08:21:04
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