| 查看: 2589 | 回复: 20 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
shiyiyaya金虫 (正式写手)
|
[求助]
克隆失败原因：NdeI+KpnI？ 已有4人参与
|
||
|
现有: 15K质粒pA，NdeI+KpnI双酶切之后产生11K+4K（回收11K做载体）； 6.7K质粒pB，NdeI+KpnI双酶切之后产生4K+2.7K（回收4K做外源DNA）; 连接回收的11K和4K。 结果失败：经多种方案鉴定，转化长出来的重组子都是质粒pB. 我已经尝试单酶切*2次、PCR扩增4K片段，重新转化质粒，挑单克隆再继续…都不行。感觉就像pB没有切干净。 请问虫友，可否遇到类似情况？NdeI+KpnI，这两个酶的活性就是低吗？ 谢谢帮忙！ |
回复此楼» 猜你喜欢
含氟糖皮质激素的外用抗炎利器醋酸氟轻松
已经有0人回复
-
阿莫奈韦（Amenamevir）：解旋酶-引物酶靶向分子的结构特征与合成路径全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有285人回复
-
利瑞鲁单抗：靶向KIR的NK细胞检查点工具抗体，结构基础与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 基因克隆失败原因，求助！
已经有10人回复
- Hind111 与 Not1双酶切请教 急急急！！！
已经有13人回复
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
shiyiyaya: 金币+2, ★有帮助 2014-03-06 08:15:32
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-03-06 12:38:57
感谢参与，应助指数 +1
shiyiyaya: 金币+2, ★有帮助 2014-03-06 08:15:32
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-03-06 12:38:57
|
既然你都切开了，那就是连接酶的问题。不知道你这个质粒的抗性如何。 此外，没图没真相啊。建议你跑一个pB没有酶切的，pB单酶切，pB双酶切的对比一下 既然出现两条带，不太可能是没切干净，感觉。 还有内切酶不行的话换个牌子的内切酶试一下。但是个人觉得你用的那个牌子的内切酶还是很强悍的。我构建过3个载体，都是用Fe***的。 有一点我很好奇，为啥你内切酶用Fe****的，连接酶用N**的。 质粒有没有切干净我个人感觉看电泳图就能说明问题。我质粒单酶切都是单一条带，没有切过的质粒都是2-3条带。 另外你说都是重组子pB，这个结论你是怎么得出来的？？测序验证？PCR检验？ 质粒、RNA跑电泳的话marker纯粹仅仅作为参照，并不能绝对反映出质粒或是RNA的真实大小！！ |
6楼2014-03-05 23:51:51
2楼2014-03-05 20:19:38
lvbobo823
铁杆木虫 (正式写手)
- 应助: 363 (硕士)
- 金币: 7753.3
- 散金: 15
- 红花: 9
- 帖子: 751
- 在线: 189.4小时
- 虫号: 819723
- 注册: 2009-07-31
- 性别: GG
- 专业: 植物遗传学
3楼2014-03-05 20:54:57
shiyiyaya
金虫 (正式写手)
- 应助: 36 (小学生)
- 金币: 1276.4
- 散金: 279
- 红花: 8
- 帖子: 301
- 在线: 63.2小时
- 虫号: 871992
- 注册: 2009-10-14
- 性别: GG
- 专业: 病毒学
4楼2014-03-05 22:53:08
