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shiyiyaya金虫 (正式写手)
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[求助]
克隆失败原因：NdeI+KpnI？已有4人参与
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现有: 15K质粒pA，NdeI+KpnI双酶切之后产生11K+4K（回收11K做载体）； 6.7K质粒pB，NdeI+KpnI双酶切之后产生4K+2.7K（回收4K做外源DNA）; 连接回收的11K和4K。 结果失败：经多种方案鉴定，转化长出来的重组子都是质粒pB. 我已经尝试单酶切*2次、PCR扩增4K片段，重新转化质粒，挑单克隆再继续…都不行。感觉就像pB没有切干净。 请问虫友，可否遇到类似情况？NdeI+KpnI，这两个酶的活性就是低吗？ 谢谢帮忙！ |
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【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
shiyiyaya: 金币+2, ★有帮助 2014-03-06 08:15:32
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-03-06 12:38:57
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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-03-06 12:38:57
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既然你都切开了，那就是连接酶的问题。不知道你这个质粒的抗性如何。 此外，没图没真相啊。建议你跑一个pB没有酶切的，pB单酶切，pB双酶切的对比一下 既然出现两条带，不太可能是没切干净，感觉。 还有内切酶不行的话换个牌子的内切酶试一下。但是个人觉得你用的那个牌子的内切酶还是很强悍的。我构建过3个载体，都是用Fe***的。 有一点我很好奇，为啥你内切酶用Fe****的，连接酶用N**的。 质粒有没有切干净我个人感觉看电泳图就能说明问题。我质粒单酶切都是单一条带，没有切过的质粒都是2-3条带。 另外你说都是重组子pB，这个结论你是怎么得出来的？？测序验证？PCR检验？ 质粒、RNA跑电泳的话marker纯粹仅仅作为参照，并不能绝对反映出质粒或是RNA的真实大小！！ |
6楼2014-03-05 23:51:51
2楼2014-03-05 20:19:38
lvbobo823
铁杆木虫 (正式写手)
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shiyiyaya
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4楼2014-03-05 22:53:08