应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 克隆失败原因：NdeI+KpnI？
51/1返回列表
查看: 2183  |  回复: 20
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

shiyiyaya

金虫 (正式写手)

[求助] 克隆失败原因：NdeI+KpnI？ 已有4人参与

现有:
15K质粒pA，NdeI+KpnI双酶切之后产生11K+4K（回收11K做载体）；
6.7K质粒pB，NdeI+KpnI双酶切之后产生4K+2.7K（回收4K做外源DNA）;

连接回收的11K和4K。

结果失败：经多种方案鉴定，转化长出来的重组子都是质粒pB.

我已经尝试单酶切*2次、PCR扩增4K片段，重新转化质粒，挑单克隆再继续…都不行。感觉就像pB没有切干净。

请问虫友，可否遇到类似情况？NdeI+KpnI，这两个酶的活性就是低吗？

谢谢帮忙！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2014-03-05 17:41:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ifyousee

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
shiyiyaya: 金币+2, ★有帮助 2014-03-06 08:15:32
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-03-06 12:38:57
既然你都切开了，那就是连接酶的问题。不知道你这个质粒的抗性如何。
此外，没图没真相啊。建议你跑一个pB没有酶切的，pB单酶切，pB双酶切的对比一下
既然出现两条带，不太可能是没切干净，感觉。
还有内切酶不行的话换个牌子的内切酶试一下。但是个人觉得你用的那个牌子的内切酶还是很强悍的。我构建过3个载体，都是用Fe***的。
有一点我很好奇，为啥你内切酶用Fe****的，连接酶用N**的。

质粒有没有切干净我个人感觉看电泳图就能说明问题。我质粒单酶切都是单一条带，没有切过的质粒都是2-3条带。

另外你说都是重组子pB，这个结论你是怎么得出来的？？测序验证？PCR检验？
质粒、RNA跑电泳的话marker纯粹仅仅作为参照，并不能绝对反映出质粒或是RNA的真实大小！！
赞一下 回复此楼
6楼2014-03-05 23:51:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 21 个回答

三蛰

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-03-05 22:48:14
shiyiyaya: 金币+2, ★有帮助 2014-03-05 23:02:49
shiyiyaya: 金币+2, ★有帮助 2014-03-06 20:28:28
酶切的话，不存在那种酶的酶活性问题，有的只是不同厂家的酶质量问题，另外存放等影响因素。当然操作时添加适当的量也是相当重要的。我觉得你说说你的酶切和连接具体操作会有助于大家对你进行分析。
赞一下 回复此楼
我不会！
2楼2014-03-05 20:19:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-03-05 22:48:20
shiyiyaya: 金币+2, ★有帮助 2014-03-05 22:53:18
建议你换换新酶分别酶切，每次酶切跑个胶看看有没有切完全，转化时加一个酶切对照看看有没有菌生长，没长说明切完全，长了但比连接产物少很多表明还可以挑选出阳性菌。
赞一下 回复此楼
hehe
3楼2014-03-05 20:54:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shiyiyaya

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lvbobo823 at 2014-03-05 20:54:57
建议你换换新酶分别酶切，每次酶切跑个胶看看有没有切完全，转化时加一个酶切对照看看有没有菌生长，没长说明切完全，长了但比连接产物少很多表明还可以挑选出阳性菌。

我试过。双酶切之后，电泳时明显切开两条带。与未酶切的质粒一起跑，条带大小明显不同，只是有一条与4K大小类似。
取4k片段直接转化，也长出来过，鉴定之后也是原来的质粒，7K左右。
我还是怀疑有一些酶切干净的质粒再里面，可是我降低质粒量，增加酶切时间等等，都不成。
未解啊！
赞一下 回复此楼
4楼2014-03-05 22:53:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 21 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 收08调剂生 +6 komorebi69 2026-03-18 6/300 2026-03-24 19:09 by 汪！？！
[考研] 一志愿211 初试270分 求调剂 +5 谷雨上岸 2026-03-23 6/300 2026-03-24 16:32 by laoshidan
[考研] 081700 调剂 267分 +9 迷人的哈哈 2026-03-23 9/450 2026-03-24 11:58 by 544594351
[考研] 生物学一志愿985，分数349求调剂 +6 zxts12 2026-03-21 9/450 2026-03-23 18:37 by macy2011
[考研] 0854电子信息求调剂 324 +3 Promise-jyl 2026-03-23 3/150 2026-03-23 13:43 by wangkm
[考研] 333求调剂 +6 87639 2026-03-21 10/500 2026-03-23 10:41 by Iveryant
[考研] 一志愿070300浙大化学358分，求调剂！ +4 酥酥鱼.. 2026-03-21 4/200 2026-03-23 08:12 by Iveryant
[考研] 352求调剂 +3 大米饭！ 2026-03-22 3/150 2026-03-22 23:28 by king123！
[考研] 一志愿 西北大学 ，070300化学学硕，总分287，双非一本，求调剂。 +3 晨昏线与星海 2026-03-20 3/150 2026-03-22 16:00 by ColorlessPI
[考研] 298求调剂一志愿211 +3 上岸6666@ 2026-03-20 3/150 2026-03-22 15:50 by ColorlessPI
[考研] 生物学调剂 +5 Surekei 2026-03-21 5/250 2026-03-22 14:39 by tcx007
[考研] 286求调剂 +10 Faune 2026-03-21 10/500 2026-03-21 23:34 by 314126402
[考研] 化学调剂 +5 yzysaa 2026-03-21 5/250 2026-03-21 22:12 by peike
[考研] 0703化学调剂 +4 妮妮ninicgb 2026-03-21 4/200 2026-03-21 18:39 by 学员8dgXkO
[考研] 22 350 本科985求调剂，求老登收留 +3 李轶男003 2026-03-20 3/150 2026-03-21 13:28 by 搏击518
[考研] 332求调剂 +3 凤凰院丁真 2026-03-20 3/150 2026-03-21 10:27 by luoyongfeng
[考研] 290求调剂 +7 ^O^乜 2026-03-19 7/350 2026-03-20 21:43 by JourneyLucky
[考研] A区线材料学调剂 +5 周周无极 2026-03-20 5/250 2026-03-20 21:33 by laoshidan
[考研] 一志愿西南交通 专硕 材料355 本科双非 求调剂 +5 西南交通专材355 2026-03-19 5/250 2026-03-20 21:10 by JourneyLucky
[考研] 一志愿福大288有机化学，求调剂 +3 小木虫200408204 2026-03-18 3/150 2026-03-19 13:31 by houyaoxu
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭