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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 克隆失败原因：NdeI+KpnI？
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shiyiyaya

金虫 (正式写手)

[求助] 克隆失败原因：NdeI+KpnI？ 已有4人参与

现有:
15K质粒pA，NdeI+KpnI双酶切之后产生11K+4K（回收11K做载体）；
6.7K质粒pB，NdeI+KpnI双酶切之后产生4K+2.7K（回收4K做外源DNA）;

连接回收的11K和4K。

结果失败：经多种方案鉴定，转化长出来的重组子都是质粒pB.

我已经尝试单酶切*2次、PCR扩增4K片段，重新转化质粒，挑单克隆再继续…都不行。感觉就像pB没有切干净。

请问虫友，可否遇到类似情况？NdeI+KpnI，这两个酶的活性就是低吗？

谢谢帮忙！
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1楼 2014-03-05 17:41:59
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shiyiyaya

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 三蛰 at 2014-03-05 20:19:38
酶切的话，不存在那种酶的酶活性问题，有的只是不同厂家的酶质量问题，另外存放等影响因素。当然操作时添加适当的量也是相当重要的。我觉得你说说你的酶切和连接具体操作会有助于大家对你进行分析。

碱裂解法小提质粒，外源DNA切于2ug质粒，载体片段切于800ng质粒，酶切总体系30ul，
10U KpnI，Fermentas, FD Buffer; 10U NdeI, Thermo scientific, o buffer.

酶切2h，条带清晰、干净。凝胶回收柱回收（生工的）。

载体片段溶于30ul TE，外源片段溶于15ul ddH2O.
连接使用NEB T4DLig，10ul体系，载体取1ul，外源全部用上，buffer、水补齐。
16度过夜、转化、鉴定。

一般来说，12个转化子，10个一样，都是外源的原始质粒，7K左右大小。其余的也不正确。

求解啊！
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5楼2014-03-05 23:02:38
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三蛰

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-03-05 22:48:14
shiyiyaya: 金币+2, ★有帮助 2014-03-05 23:02:49
shiyiyaya: 金币+2, ★有帮助 2014-03-06 20:28:28
酶切的话，不存在那种酶的酶活性问题，有的只是不同厂家的酶质量问题，另外存放等影响因素。当然操作时添加适当的量也是相当重要的。我觉得你说说你的酶切和连接具体操作会有助于大家对你进行分析。
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我不会！
2楼2014-03-05 20:19:38
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-03-05 22:48:20
shiyiyaya: 金币+2, ★有帮助 2014-03-05 22:53:18
建议你换换新酶分别酶切，每次酶切跑个胶看看有没有切完全，转化时加一个酶切对照看看有没有菌生长，没长说明切完全，长了但比连接产物少很多表明还可以挑选出阳性菌。
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hehe
3楼2014-03-05 20:54:57
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shiyiyaya

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lvbobo823 at 2014-03-05 20:54:57
建议你换换新酶分别酶切，每次酶切跑个胶看看有没有切完全，转化时加一个酶切对照看看有没有菌生长，没长说明切完全，长了但比连接产物少很多表明还可以挑选出阳性菌。

我试过。双酶切之后，电泳时明显切开两条带。与未酶切的质粒一起跑，条带大小明显不同，只是有一条与4K大小类似。
取4k片段直接转化，也长出来过，鉴定之后也是原来的质粒，7K左右。
我还是怀疑有一些酶切干净的质粒再里面，可是我降低质粒量，增加酶切时间等等，都不成。
未解啊！
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4楼2014-03-05 22:53:08
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