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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 克隆失败原因：NdeI+KpnI？
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my1987

金虫 (初入文坛)
我可以说我遇到过和楼主一样的问题吗？
当时，也是质粒双酶切，然后连接，转化，最后结果转化子有很多自连的。
因为我当时做的外源片段是基因合成的，挺多个外源片段（十几个吧），有的挑3,4个转化子，就有重组质粒，有的挑了20多个才有重组质粒，具体原因一直搞不清楚，当时时间有很赶，就靠重复劳动搞定的。问了很多人，还是搞不明白。
我到现在还是很想了解下为什么啊为什么
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11楼2014-03-06 10:07:13
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-03-06 12:39:30
感觉你的pB没有酶切完全。或者 回收胶的时候把2.7K的也给切了一些。建议跑胶低电压，高浓度胶，长时间后切胶。
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12楼2014-03-06 10:25:35
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shiyiyaya

金虫 (正式写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-03-06 10:25:35
感觉你的pB没有酶切完全。或者 回收胶的时候把2.7K的也给切了一些。建议跑胶低电压，高浓度胶，长时间后切胶。

嗯，目前也正在努力排出这个原因。谢谢！
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13楼2014-03-06 10:55:07
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shiyiyaya

金虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by my1987 at 2014-03-06 10:07:13
我可以说我遇到过和楼主一样的问题吗？
当时，也是质粒双酶切，然后连接，转化，最后结果转化子有很多自连的。
因为我当时做的外源片段是基因合成的，挺多个外源片段（十几个吧），有的挑3,4个转化子，就有重组质 ...

是啊，相同感受！其他克隆做了不知多少，从没遇到这么麻烦的！15K的病毒基因组也连接到3K的小载体里，导了几步而已，平末端的、脱磷的也都做过…没想到如今的一个双粘把自己难住了！哎…技术不精吧，或许这就是原因。
还在努力中…
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14楼2014-03-06 10:57:18
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奋斗不懈

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
看一下你的引物是不是有问题，加的酶切位点是不是对。从头认真检查一下，细节决定成败。
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15楼2014-03-06 11:04:11
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三蛰

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by shiyiyaya at 2014-03-05 23:02:38
碱裂解法小提质粒，外源DNA切于2ug质粒，载体片段切于800ng质粒，酶切总体系30ul，
10U KpnI，Fermentas, FD Buffer; 10U NdeI, Thermo scientific, o buffer.

酶切2h，条带清晰、干净。凝胶回收柱回收（生工的 ...

我有一个比较好的连结体系是根据摩尔数来进行具体的换算：
在20ul连接体系当中：
载体用量：0.1pmol X 324.5/mol X （载体碱基数）结果换算一下得到多少ng
目的片段用量：0.6 X 324.5 X （目的片段碱基数） 结果把单位换算一下得到ng
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我不会！
16楼2014-03-06 11:06:18
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by shiyiyaya at 2014-03-06 10:55:07
嗯，目前也正在努力排出这个原因。谢谢！...

不客气
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17楼2014-03-06 14:34:14
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ifyousee

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
shiyiyaya: 金币+2, ★有帮助 2014-03-06 20:27:50
引用回帖:
9楼: Originally posted by shiyiyaya at 2014-03-06 08:17:29
重组子经4种酶切方案鉴定过，与pB一致。
另，我说的~7K，是经过单切之后，与pB大小一致。并不是直接说质粒等的大小。

我头疼的就是，明明切的干净，可结果却貌似没有切干净。
如果说存在污染，后续我重新将pB ...

大侠重新来过吧。有时候分析问题还不如重做。
质粒你有，酶切也不是问题，这些很快都可以做完的。然后感受态细胞重新做过（有钱的话重新买过）。
看你这么纠结，我都想替你连接过了。呵呵
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18楼2014-03-06 17:10:48
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shiyiyaya

金虫 (正式写手)
引用回帖:
18楼: Originally posted by ifyousee at 2014-03-06 17:10:48
大侠重新来过吧。有时候分析问题还不如重做。
质粒你有，酶切也不是问题，这些很快都可以做完的。然后感受态细胞重新做过（有钱的话重新买过）。
看你这么纠结，我都想替你连接过了。呵呵...

是啊，老板也跟着纠结，建议了2个同学帮忙，独立完成。可结果和我的一样。现在也尝试其他构建方案，也在试着排除污染。
要是我解决了，或许可以作为研究生复试时的面试题目了。哎…希望明天的鉴定顺利啊！
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19楼2014-03-06 20:27:43
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ytetyio09

新虫 (正式写手)
可以试试这篇论文的方法，虽然是个小的改进，但是值得一试，而且很方便：
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24613256
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20楼2014-03-25 09:41:28
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