应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 克隆失败原因：NdeI+KpnI？
52/1返回列表
查看: 2255  |  回复: 20
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

shiyiyaya

金虫 (正式写手)

[求助] 克隆失败原因：NdeI+KpnI？ 已有4人参与

现有:
15K质粒pA，NdeI+KpnI双酶切之后产生11K+4K（回收11K做载体）；
6.7K质粒pB，NdeI+KpnI双酶切之后产生4K+2.7K（回收4K做外源DNA）;

连接回收的11K和4K。

结果失败：经多种方案鉴定，转化长出来的重组子都是质粒pB.

我已经尝试单酶切*2次、PCR扩增4K片段，重新转化质粒，挑单克隆再继续…都不行。感觉就像pB没有切干净。

请问虫友，可否遇到类似情况？NdeI+KpnI，这两个酶的活性就是低吗？

谢谢帮忙！
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2014-03-05 17:41:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

奋斗不懈

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
看一下你的引物是不是有问题，加的酶切位点是不是对。从头认真检查一下，细节决定成败。
赞一下 回复此楼
15楼2014-03-06 11:04:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 21 个回答

三蛰

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-03-05 22:48:14
shiyiyaya: 金币+2, ★有帮助 2014-03-05 23:02:49
shiyiyaya: 金币+2, ★有帮助 2014-03-06 20:28:28
酶切的话，不存在那种酶的酶活性问题，有的只是不同厂家的酶质量问题，另外存放等影响因素。当然操作时添加适当的量也是相当重要的。我觉得你说说你的酶切和连接具体操作会有助于大家对你进行分析。
赞一下 回复此楼
我不会！
2楼2014-03-05 20:19:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-03-05 22:48:20
shiyiyaya: 金币+2, ★有帮助 2014-03-05 22:53:18
建议你换换新酶分别酶切，每次酶切跑个胶看看有没有切完全，转化时加一个酶切对照看看有没有菌生长，没长说明切完全，长了但比连接产物少很多表明还可以挑选出阳性菌。
赞一下 回复此楼
hehe
3楼2014-03-05 20:54:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shiyiyaya

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lvbobo823 at 2014-03-05 20:54:57
建议你换换新酶分别酶切，每次酶切跑个胶看看有没有切完全，转化时加一个酶切对照看看有没有菌生长，没长说明切完全，长了但比连接产物少很多表明还可以挑选出阳性菌。

我试过。双酶切之后，电泳时明显切开两条带。与未酶切的质粒一起跑，条带大小明显不同，只是有一条与4K大小类似。
取4k片段直接转化，也长出来过，鉴定之后也是原来的质粒，7K左右。
我还是怀疑有一些酶切干净的质粒再里面，可是我降低质粒量，增加酶切时间等等，都不成。
未解啊！
赞一下 回复此楼
4楼2014-03-05 22:53:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 21 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 一志愿沪9，生物学326求调剂 +7 刘墨墨 2026-04-15 7/350 2026-04-15 18:51 by 浮云166
[考研] 0854调剂 +13 长弓傲 2026-04-12 16/800 2026-04-15 13:45 by fenglj492
[考研] 310求调剂 +16 666真好 2026-04-11 18/900 2026-04-15 13:28 by 黑科技矿业
[考研] 211本科材料化工求调剂 +19 YHLAH 2026-04-11 23/1150 2026-04-14 22:25 by fenglj492
[考研] 297求调剂 +23 ORCHID1 2026-04-10 26/1300 2026-04-14 13:52 by 陈皮皮
[考研] 食品与营养（0955）271求调剂 +15 升格阿达 2026-04-12 16/800 2026-04-14 13:18 by 浮若_安生
[考研] 0856专硕求调剂 希望是a区院校 +24 好好休息好不好 2026-04-09 27/1350 2026-04-13 22:22 by pies112
[考研] 0854调剂 +10 长弓傲 2026-04-11 11/550 2026-04-13 10:38 by wp06
[考研] 一志愿085802 323分求调剂 +13 drizzle_9 2026-04-12 14/700 2026-04-13 10:26 by Faiz5552
[考研] 求调剂288 +7 ioodiiij 2026-04-10 9/450 2026-04-13 08:33 by Hayaay
[找工作] 山东高校教师考核超级无底线，员工过不下去啦 +4 qut2026 2026-04-09 9/450 2026-04-12 00:54 by qut2026
[考研] 280求调剂 +13 wzzz王 2026-04-09 13/650 2026-04-12 00:31 by 勇攀高峰0126
[考研] 087100初试311求调剂 +4 任雅琴 2026-04-09 4/200 2026-04-11 10:33 by zhq0425
[考研] 281求调剂 +11 觉得好的吧 2026-04-10 11/550 2026-04-11 09:35 by 逆水乘风
[考研] 284求调剂 +12 archer.. 2026-04-10 13/650 2026-04-11 08:44 by zhq0425
[考研] 一志愿北理工298英一数二已上岸，感谢各位老师 +14 Reframe 2026-04-10 16/800 2026-04-10 23:07 by caotw2020
[考研] 吉大计算机技术331分，英语六级，求调剂 +3 峰峰021116 2026-04-09 3/150 2026-04-10 20:01 by chemisry
[考研] 301求调剂 +5 149. 2026-04-10 5/250 2026-04-10 15:45 by 柴小白
[考研] 292求调剂 +9 笑笑袁 2026-04-09 9/450 2026-04-10 10:05 by LHGeng
[考研] 材料专硕初试分332一志愿西北工业大学， +12 故人?? 2026-04-09 12/600 2026-04-09 18:34 by Ccclqqq
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭