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shiyiyaya

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[求助] 克隆失败原因：NdeI+KpnI？已有4人参与

现有:
15K质粒pA，NdeI+KpnI双酶切之后产生11K+4K（回收11K做载体）；
6.7K质粒pB，NdeI+KpnI双酶切之后产生4K+2.7K（回收4K做外源DNA）;

连接回收的11K和4K。

结果失败：经多种方案鉴定，转化长出来的重组子都是质粒pB.

我已经尝试单酶切*2次、PCR扩增4K片段，重新转化质粒，挑单克隆再继续…都不行。感觉就像pB没有切干净。

请问虫友，可否遇到类似情况？NdeI+KpnI，这两个酶的活性就是低吗？

谢谢帮忙！

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1楼 2014-03-05 17:41:59

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shiyiyaya

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引用回帖:

6楼: Originally posted by ifyousee at 2014-03-05 23:51:51
既然你都切开了，那就是连接酶的问题。不知道你这个质粒的抗性如何。
此外，没图没真相啊。建议你跑一个pB没有酶切的，pB单酶切，pB双酶切的对比一下
既然出现两条带，不太可能是没切干净，感觉。
还有内切酶不行 ...

重组子经4种酶切方案鉴定过，与pB一致。
另，我说的~7K，是经过单切之后，与pB大小一致。并不是直接说质粒等的大小。

我头疼的就是，明明切的干净，可结果却貌似没有切干净。
如果说存在污染，后续我重新将pB转化，挑单克隆，也没成。

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9楼2014-03-06 08:17:29

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三蛰

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-03-05 22:48:14
shiyiyaya: 金币+2, ★有帮助 2014-03-05 23:02:49
shiyiyaya: 金币+2, ★有帮助 2014-03-06 20:28:28

酶切的话，不存在那种酶的酶活性问题，有的只是不同厂家的酶质量问题，另外存放等影响因素。当然操作时添加适当的量也是相当重要的。我觉得你说说你的酶切和连接具体操作会有助于大家对你进行分析。

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我不会！